本發(fā)明涉及生物，具體涉及一種基于單細胞bcr測序的新布尼亞病毒中和抗體篩選方法。
背景技術(shù)：
1、新布尼亞病毒(sftsv)感染可導致嚴重的免疫系統(tǒng)失調(diào)和高病死率。目前針對sftsv的免疫應答研究主要依賴于流式細胞術(shù)(facs)和elisa檢測b細胞群體及抗體水平，但這些方法僅能提供群體水平數(shù)據(jù)，無法解析單個b細胞的bcr克隆擴增、親和力成熟及體細胞高頻突變(shm)。現(xiàn)有高通量測序技術(shù)(如bulk?rna-seq)雖可獲取bcr序列，但缺乏單細胞分辨率，難以區(qū)分不同b細胞亞群的免疫特征。因此亟需一種基于單細胞測序的bcr分析方法，以精準解析sftsv感染者的免疫應答特征，并為中和抗體的發(fā)現(xiàn)提供技術(shù)支撐。
2、基于此，本發(fā)明提供了一種基于單細胞bcr測序的新布尼亞病毒中和抗體篩選方法。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、本發(fā)明旨在通過單細胞測序技術(shù)結(jié)合bcr克隆分析，解析sftsv感染者的b細胞免疫應答動態(tài)，發(fā)現(xiàn)與疾病嚴重程度相關(guān)的特征性bcr克隆模式及潛在中和抗體靶點，為疫苗設(shè)計、抗體藥物開發(fā)及臨床監(jiān)測提供依據(jù)。
2、一方面，本發(fā)明提供一種基于單細胞bcr測序的新布尼亞病毒中和抗體篩選方法，步驟包括樣本采集、單細胞文庫構(gòu)建、測序、生物信息學分析及篩選。
3、1、進一步地，步驟包括：
4、s1、采集新布尼亞病毒感染者急性期、恢復期患者及健康志愿者的外周血b細胞；
5、s2、通過cd19+cd38+cd138+磁珠分選獲得單細胞懸液；
6、s3、構(gòu)建單細胞轉(zhuǎn)錄組及bcr文庫，利用微流控系統(tǒng)分離單細胞并進行高通量測序；
7、s4、通過生物信息學分析解析b細胞亞群、bcr克隆擴增模式及vj基因?qū)Ω患卣鳎?/p>
8、s5、篩選與疾病嚴重程度相關(guān)的特異性bcr克隆型，作為中和抗體候選靶點。
9、進一步地，所述感染者急性期為病毒感染核酸陽性期；所述恢復期患者為核酸轉(zhuǎn)陰超過一周后的患者；所述健康志愿者為未有新布病毒感染史，無其他基礎(chǔ)性疾病志愿者。
10、進一步地，所述測序采用illumina?hiseqx/nova測序平臺，測序策略為pe150，每個轉(zhuǎn)錄組文庫測序數(shù)據(jù)量不低于90g。
11、進一步地，所述文庫構(gòu)建方式為：具備singleron文庫構(gòu)建系統(tǒng)，基于微流控微孔技術(shù)原理完成單個細胞分離并通過帶barcode及umi的磁珠對mrna進行捕獲標記；搭配使用單細胞轉(zhuǎn)錄組建庫試劑和單細胞免疫受體試劑盒，完成單細胞轉(zhuǎn)錄組文庫和bcr文庫的構(gòu)建。
12、進一步地，所述文庫構(gòu)建過程中，使用組織保存液和解離液處理樣本，細胞活性≥85％，濃度≥1×10^5cells/ml。
13、進一步地，所述生物信息學分析內(nèi)容包括對測序數(shù)據(jù)進行質(zhì)控、比對和定量，獲得單細胞表達譜矩陣，去除測序質(zhì)量不達標的細胞。
14、進一步地，所述生物信息學分析內(nèi)容還包括多樣本的單細胞表達譜數(shù)據(jù)進行批次間整合，并去除技術(shù)噪音導致的批次差異。
15、進一步地，所述生物信息學分析內(nèi)容還包括marker基因分析、軌跡分析、細胞通訊分析、功能富集分析、tf編碼能力預測、細胞周期分析和蛋白互作分析中的至少一種。
16、本發(fā)明的有益效果在于：
17、本發(fā)明通過單細胞測序技術(shù)實現(xiàn)了對sftsv感染者b細胞免疫應答的高精度解析，克服了現(xiàn)有技術(shù)僅能提供群體水平數(shù)據(jù)的局限性。這一方法不僅能夠細分b細胞亞群，還能揭示急性期、恢復期和健康人群b細胞的動態(tài)變化，為理解疾病進程提供了重要依據(jù)；
18、本發(fā)明在bcr克隆分析方面取得了顯著進展，能夠解析單細胞分辨率下的克隆譜，并鑒定出與疾病嚴重程度相關(guān)的bcr克隆擴增模式，特別是發(fā)現(xiàn)了特定vj基因?qū)?iglv2-14_iglj1,iglv2-14_iglj2)在sftsv重癥患者中的富集現(xiàn)象，為開發(fā)sftsv特異性抗體提供了候選靶點，極大地推進了抗體藥物的開發(fā)進程。
19、本發(fā)明通過細胞分化軌跡分析及抗病毒基因在b細胞中的動態(tài)變化研究，進一步揭示了b細胞在抗病毒免疫應答中的作用機制，這些發(fā)現(xiàn)不僅具有重要的科研價值，還為新布尼亞病毒感染的免疫監(jiān)測、疫苗設(shè)計提供了有力支持，有望為臨床治療和預防提供新的策略和方法。
1.一種基于單細胞bcr測序的新布尼亞病毒中和抗體篩選方法，其特征在于，步驟包括樣本采集、單細胞文庫構(gòu)建、測序、生物信息學分析及篩選。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于單細胞bcr測序的新布尼亞病毒中和抗體篩選方法，其特征在于，步驟包括：
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于單細胞bcr測序的新布尼亞病毒中和抗體篩選方法，其特征在于，所述感染者急性期為病毒感染核酸陽性期；所述恢復期患者為核酸轉(zhuǎn)陰超過一周后的患者；所述健康志愿者為未有新布病毒感染史，無其他基礎(chǔ)性疾病志愿者。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于單細胞bcr測序的新布尼亞病毒中和抗體篩選方法，其特征在于，所述測序采用illumina?hiseqx/nova測序平臺，測序策略為pe150，每個轉(zhuǎn)錄組文庫測序數(shù)據(jù)量不低于90g。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于單細胞bcr測序的新布尼亞病毒中和抗體篩選方法，其特征在于，所述文庫構(gòu)建方式為：具備singleron文庫構(gòu)建系統(tǒng)，基于微流控微孔技術(shù)原理完成單個細胞分離并通過帶barcode及umi的磁珠對mrna進行捕獲標記；搭配使用單細胞轉(zhuǎn)錄組建庫試劑和單細胞免疫受體試劑盒，完成單細胞轉(zhuǎn)錄組文庫和bcr文庫的構(gòu)建。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種基于單細胞bcr測序的新布尼亞病毒中和抗體篩選方法，其特征在于，所述文庫構(gòu)建過程中，使用組織保存液和解離液處理樣本，細胞活性≥85％，濃度≥1×10^5cells/ml。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于單細胞bcr測序的新布尼亞病毒中和抗體篩選方法，所述生物信息學分析內(nèi)容包括對測序數(shù)據(jù)進行質(zhì)控、比對和定量，獲得單細胞表達譜矩陣，去除測序質(zhì)量不達標的細胞。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于單細胞bcr測序的新布尼亞病毒中和抗體篩選方法，其特征在于，所述生物信息學分析內(nèi)容還包括多樣本的單細胞表達譜數(shù)據(jù)進行批次間整合，并去除技術(shù)噪音導致的批次差異。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于單細胞bcr測序的新布尼亞病毒中和抗體篩選方法，其特征在于，所述生物信息學分析內(nèi)容還包括marker基因分析、軌跡分析、細胞通訊分析、功能富集分析、tf編碼能力預測、細胞周期分析和蛋白互作分析中的至少一種。