本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因檢測(cè)，尤其是涉及一種基于多重?zé)晒鈖cr鑒定純合型和雜合型轉(zhuǎn)基因玉米ncx-1的方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
1、隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，轉(zhuǎn)基因作物的研發(fā)和產(chǎn)業(yè)化迅猛發(fā)展。根據(jù)國(guó)際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用服務(wù)組織發(fā)布的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，2023年全球轉(zhuǎn)基因作物的種植面積達(dá)2.063億公頃。雖然轉(zhuǎn)基因作物在品種抗性、營(yíng)養(yǎng)改良等方面表現(xiàn)優(yōu)良，但其安全性問(wèn)題引起了公眾的廣泛關(guān)注。而轉(zhuǎn)基因定性定量檢測(cè)技術(shù)，是支撐轉(zhuǎn)基因產(chǎn)業(yè)化管理、標(biāo)識(shí)監(jiān)管等制度順利實(shí)施的重要保障。
2、轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品成分檢測(cè)的一個(gè)重要物質(zhì)基礎(chǔ)是轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，而原材料純合度鑒定是制備標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前，轉(zhuǎn)基因植物純合度鑒定方法主要是采用實(shí)時(shí)熒光定量pcr方法、數(shù)字pcr方法。實(shí)時(shí)熒光定量pcr方法有許多優(yōu)勢(shì)，如快速、靈敏，但是在純合度的精確性方面一致受到質(zhì)疑。此外，采用實(shí)時(shí)熒光定量pcr方法進(jìn)行純合度鑒定必須先建立標(biāo)準(zhǔn)曲線且內(nèi)源基因和外源基因的擴(kuò)增效率一致或非常接近。同時(shí)這種方法還需已知純合度的校準(zhǔn)品作為校準(zhǔn)材料。因此，實(shí)時(shí)熒光定量pcr法的應(yīng)用受到很大的限制。數(shù)字pcr方法除具有實(shí)時(shí)熒光定量pcr方法的優(yōu)勢(shì)外，還具有耐抑制物及鑒定精確等優(yōu)點(diǎn)。但是數(shù)字pcr方法也存在鑒定通量低、耗費(fèi)高等缺點(diǎn)。
3、有鑒于此，特提出本發(fā)明。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本發(fā)明的目的之一在于提供一種基于多重?zé)晒鈖cr鑒定純合型和雜合型轉(zhuǎn)基因玉米ncx-1的方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)中數(shù)字pcr通量低耗費(fèi)高或?qū)崟r(shí)熒光定量pcr須先建立標(biāo)準(zhǔn)曲線且內(nèi)源基因和外源基因的擴(kuò)增效率一致或非常接近，及精確性存在質(zhì)疑的技術(shù)問(wèn)題。
2、本發(fā)明的目的之二在于提供上述的方法在轉(zhuǎn)基因玉米ncx-1的雜交育種及標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或原材料鑒定中的應(yīng)用。
3、為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術(shù)方案：
4、第一方面，本發(fā)明提供了一種基于多重?zé)晒鈖cr鑒定純合型和雜合型轉(zhuǎn)基因玉米ncx-1的方法，包括以待測(cè)樣品dna為模板進(jìn)行多重?zé)晒鈖cr擴(kuò)增，根據(jù)靶標(biāo)擴(kuò)增曲線判斷待測(cè)樣品為純合型或雜合型轉(zhuǎn)基因玉米ncx-1；
5、所述靶標(biāo)擴(kuò)增曲線包括內(nèi)參基因擴(kuò)增曲線、轉(zhuǎn)化體特異性擴(kuò)增曲線和純合性鑒定擴(kuò)增曲線。
6、進(jìn)一步的，所述根據(jù)靶標(biāo)擴(kuò)增曲線判斷待測(cè)樣品為純合型或雜合型轉(zhuǎn)基因玉米ncx-1包括：
7、若內(nèi)參基因擴(kuò)增曲線和轉(zhuǎn)化體特異性擴(kuò)增曲線均為典型擴(kuò)增曲線，純合性鑒定擴(kuò)增曲線為非典型擴(kuò)增曲線，則待測(cè)樣品為純合型；
8、若內(nèi)參基因擴(kuò)增曲線、轉(zhuǎn)化體特異性擴(kuò)增曲線和純合性鑒定擴(kuò)增曲線均為典型擴(kuò)增曲線，則待測(cè)樣品為雜合型。
9、進(jìn)一步的，用于擴(kuò)增純合性鑒定的引物對(duì)包括ncx-1-5f和ncx-1-3r，其核苷酸序列如seq?id?no.1和seq?id?no.2所示；
10、用于擴(kuò)增純合性鑒定擴(kuò)增曲線的探針包括ncx-1-3p，其核苷酸序列如seq?idno.5所示。
11、進(jìn)一步的，用于擴(kuò)增內(nèi)參基因的pcr引物對(duì)包括zssiib-f和zssiib-r，其核苷酸序列如seq?id?no.7和seq?id?no.8所示；
12、用于擴(kuò)增內(nèi)參基因的探針包括zssiib-p，其核苷酸序列如seq?id?no.9所示。
13、進(jìn)一步的，用于擴(kuò)增轉(zhuǎn)化體特異性的pcr引物對(duì)包括ncx-1-5f和ncx-1-5r，其核苷酸序列如seq?id?no.1和seq?id?no.10所示；
14、用于擴(kuò)增轉(zhuǎn)化體特異性的探針包括ncx-1-5p，其核苷酸序列如seq?id?no.4所示。
15、進(jìn)一步的，所述多重?zé)晒鈖cr的反應(yīng)體系中ncx-1-5f、ncx-1-3r、zssiib-f、zssiib-r和ncx-1-5r的摩爾比為1:1:1:1:1。
16、進(jìn)一步的，ncx-1-3p、zssiib-p和ncx-1-5p的摩爾比為1:1:1。
17、進(jìn)一步的，所述ncx-1-5f、ncx-1-3r、zssiib-f、zssiib-r和ncx-1-5r的終濃度均為0.4μm；
18、所述ncx-1-3p、zssiib-p和ncx-1-5p的終濃度均為0.2μm。
19、進(jìn)一步的，所述多重?zé)晒鈖cr的擴(kuò)增條件包括95℃預(yù)變性5min；95℃變性15sec；60℃退火及延伸60sec，共40個(gè)循環(huán)；98℃10min，4℃保存，升降溫速度保持在2℃/秒。
20、第二方面，本發(fā)明提供了上述的方法在轉(zhuǎn)基因玉米ncx-1的雜交育種及標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或原材料鑒定中的應(yīng)用。
21、本發(fā)明提供的基于多重?zé)晒鈖cr鑒定純合型和雜合型轉(zhuǎn)基因玉米ncx-1的方法，首次公開(kāi)利用多重?zé)晒鈖cr技術(shù)獲得靶標(biāo)擴(kuò)增曲線，建立了鑒定純合型和雜合型轉(zhuǎn)基因玉米ncx-1的方法；與數(shù)字pcr技術(shù)相比，多重?zé)晒鈖cr技術(shù)具有相同的可靠性且更加快速、高效、耗費(fèi)低；與實(shí)時(shí)熒光定量pcr方法相比，解決了實(shí)時(shí)熒光定量pcr鑒定純合型或雜合型轉(zhuǎn)基因生物存在的鑒定不精確、必須先建立標(biāo)準(zhǔn)曲線及需要校準(zhǔn)品的問(wèn)題；本發(fā)明提供的方法為雜交育種及標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或原材料的繁殖鑒定工作奠定基礎(chǔ)，保障材料背景的真實(shí)可靠。
1.一種基于多重?zé)晒鈖cr鑒定純合型和雜合型轉(zhuǎn)基因玉米ncx-1的方法，其特征在于，包括以待測(cè)樣品dna為模板進(jìn)行多重?zé)晒鈖cr擴(kuò)增，根據(jù)靶標(biāo)擴(kuò)增曲線判斷待測(cè)樣品為純合型或雜合型轉(zhuǎn)基因玉米ncx-1；
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述根據(jù)靶標(biāo)擴(kuò)增曲線判斷待測(cè)樣品為純合型或雜合型轉(zhuǎn)基因玉米ncx-1包括：
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，用于擴(kuò)增純合性鑒定的引物對(duì)包括ncx-1-5f和ncx-1-3r，其核苷酸序列如seq?id?no.1和seq?id?no.2所示；
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，用于擴(kuò)增內(nèi)參基因的pcr引物對(duì)包括zssiib-f和zssiib-r，其核苷酸序列如seq?id?no.7和seq?id?no.8所示；
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，用于擴(kuò)增轉(zhuǎn)化體特異性的pcr引物對(duì)包括ncx-1-5f和ncx-1-5r，其核苷酸序列如seq?id?no.1和seq?id?no.10所示；
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述多重?zé)晒鈖cr的反應(yīng)體系中ncx-1-5f、ncx-1-3r、zssiib-f、zssiib-r和ncx-1-5r的摩爾比為1:1:1:1:1。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，ncx-1-3p、zssiib-p和ncx-1-5p的摩爾比為1:1:1。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述ncx-1-5f、ncx-1-3r、zssiib-f、zssiib-r和ncx-1-5r的終濃度均為0.4μm；
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述多重?zé)晒鈖cr的擴(kuò)增條件包括95℃預(yù)變性5min；95℃變性15sec；60℃退火及延伸60sec，共40個(gè)循環(huán)；98℃10min，4℃保存，升降溫速度保持在2℃/秒。
10.權(quán)利要求1～9任一項(xiàng)所述的方法在轉(zhuǎn)基因玉米ncx-1的雜交育種及標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或原材料鑒定中的應(yīng)用。