本發(fā)明涉及干細胞培養(yǎng)，具體涉及一種間充質干細胞的培養(yǎng)方法。
背景技術：
1、間充質干細胞(mesenchymal?stem?cells,mscs)是一類來源于中胚層的成體干細胞，具有自我更新和多向分化的潛能。研究表明mscs廣泛存在于成體及胎兒的各種組織中，如骨髓、外周血、脂肪組織、羊膜和臍帶、胎盤、牙髓、皮膚等中。
2、人臍帶的華通氏膠內含有豐富的臍帶間充質干細胞，作為一種較原始的間充質干細胞，具有容易獲得、較低的免疫原性和多向分化的特點，成功避開了胚胎干細胞和骨髓間充質干細胞在使用過程中的諸多限制，從而被廣泛應用。
3、人臍帶的結締組織是間充質干細胞豐富的組織來源，目前臍帶間充質干細胞的分離和培養(yǎng)方法主要是剝離臍帶華通氏膠后酶解消化再培養(yǎng)傳代，但是在現(xiàn)有操作中常常存在酶解消化不穩(wěn)定的現(xiàn)象，酶解消化時間過長或酶濃度較高可能會損傷細胞膜，影響后續(xù)細胞傳代的活性；在此基礎上往往是通過降低酶濃度或者縮短酶消化時間來控制，但是消化處理時間較短也會造成細胞團塊未完全分散消化不徹底的現(xiàn)象，影響后續(xù)傳代的細胞生長，在此基礎上增強細胞消化酶解的穩(wěn)定性，提升細胞傳代培養(yǎng)的效率是現(xiàn)階段間充質干細胞培養(yǎng)的一大重要研究方向。
技術實現(xiàn)思路
1、針對現(xiàn)有技術不足，本發(fā)明提供一種間充質干細胞的培養(yǎng)方法，有效穩(wěn)定干細胞酶解消化環(huán)境，同時促進后續(xù)傳代增殖的效率。
2、為實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明通過以下技術方案予以實現(xiàn)：
3、一種間充質干細胞的培養(yǎng)方法，所述培養(yǎng)方法包括以下步驟：
4、s1、保護劑制備：將生理鹽水+10mm?hepes+2％海藻糖混合制成保護劑；
5、s2、傳代培養(yǎng)基的制備：dmem-f12培養(yǎng)基+10％胎牛血清+0.1mm軟脂酸鈉+fgf-25ng/ml制備得到傳代培養(yǎng)基；
6、s3、樣本分離：分離臍帶華通氏膠后離心切段得組織塊；
7、s4、組織接種培養(yǎng)：將組織塊干貼培養(yǎng)后加入dmem-f12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)10-14d；
8、s5、原代細胞消化：除去培養(yǎng)基和貼壁的組織塊，后加入上述保護劑浸潤后處理20-30min，再添加消化液進行消化處理2-3min，終止消化，過濾離心得原代間充質干細胞；
9、s6、細胞接種：將上述原代間充質干細胞重懸后按照4000～8000個/cm2的密度接種于培養(yǎng)瓶中，采用傳代培養(yǎng)基培養(yǎng)；
10、s7、傳代培養(yǎng)：培養(yǎng)至細胞融合度達到85％-90％，除去培養(yǎng)基，加入上述保護劑浸潤后處理20-30min，再添加消化液進行消化處理2-3min，終止消化，過濾離心后重懸重復s6-s7步驟進行傳代。
11、優(yōu)選的，所述步驟s3中的具體操作方式包括以下步驟：
12、s3-1、將臍帶樣本消毒后除去血凝塊，后生理鹽水清洗干凈；
13、s3-2、縱向剖開臍帶，剔除臍靜脈和臍動脈，撕取華通氏膠于裝有生理鹽水的50ml離心管中；
14、s3-3、將上述離心管在1500rpm，離心10min，除去生理鹽水，將剩余華通氏膠組織切成大小為1-3mm2的組織塊。
15、優(yōu)選的，所述步驟s4中的具體操作方式包括以下步驟：
16、s4-1、將組織塊均勻的接種在t175瓶中，滴加dmem-f12培養(yǎng)基使組織塊保持潤濕狀態(tài)，接種后，于37℃，5％co2培養(yǎng)箱中靜置1h進行干貼；
17、s4-2、向t175瓶中加入dmem-f12培養(yǎng)基至組織塊完全浸沒，繼續(xù)在37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10-14d。
18、優(yōu)選的，所述步驟s4-1中接種的組織塊為3～5ml，間距在0.5±0.1cm。
19、優(yōu)選的，所述步驟s4-2的培養(yǎng)過程中根據(jù)組織塊濕潤程度及時進行補液，若培養(yǎng)基顏色變黃則進行換液。
20、優(yōu)選的，所述步驟s5和s7中的消化液的配方為：0.25％胰酶+0.02％edta+無ca2+/mg2+的pbs。
21、優(yōu)選的，所述步驟s5和s7中終止消化的方式為添加消化液3倍體積以上的10％胎牛血清+dmem-f12培養(yǎng)基混合溶液。
22、優(yōu)選的，所述步驟s5和s7中過濾離心的操作為采用細胞篩網(wǎng)進行過濾，后在1500rpm轉速下離心10min。
23、優(yōu)選的，所述傳代培養(yǎng)的條件為37℃，5％co2培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)。
24、本發(fā)明提供一種間充質干細胞的培養(yǎng)方法，與現(xiàn)有技術相比優(yōu)點在于：
25、本發(fā)明在進行酶解消化前采用保護劑對組織細胞進行浸潤，能夠有效控制細胞后續(xù)酶解消化時受損，保證細胞的活性，提高細胞分離效率，獲得高活率的細胞，便于后續(xù)的傳代培養(yǎng)，同時在培養(yǎng)基中添加一定量的軟脂酸鈉能夠有效促進細胞的傳代增殖。
1.一種間充質干細胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述培養(yǎng)方法包括以下步驟：
2.根據(jù)權利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟s3中的具體操作方式包括以下步驟：
3.根據(jù)權利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟s4中的具體操作方式包括以下步驟：
4.根據(jù)權利要求3所述的培養(yǎng)方法，其特征在于：所述步驟s4-1中接種的組織塊為3～5ml，間距在0.5±0.1cm。
5.根據(jù)權利要求3所述的培養(yǎng)方法，其特征在于：所述步驟s4-2的培養(yǎng)過程中根據(jù)組織塊濕潤程度及時進行補液，若培養(yǎng)基顏色變黃則進行換液。
6.根據(jù)權利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟s5和s7中的消化液的配方為：0.25％胰酶+0.02％edta+無ca2+/mg2+的pbs。
7.根據(jù)權利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于：所述步驟s5和s7中終止消化的方式為添加消化液3倍體積以上的10％胎牛血清+dmem-f12培養(yǎng)基混合溶液。
8.根據(jù)權利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于：所述步驟s5和s7中過濾離心的操作為采用細胞篩網(wǎng)進行過濾，后在1500rpm轉速下離心10min。
9.根據(jù)權利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于：所述傳代培養(yǎng)的條件為37℃，5％co2培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)。