背景技術(shù)：

1、外來體是細(xì)胞間通訊的重要中介物。它們也是許多疾病(如癌癥)的診斷和預(yù)后的重要生物標(biāo)記物。作為藥物遞送媒介物，外來體作為一種新的治療方式在許多治療領(lǐng)域提供了許多優(yōu)于傳統(tǒng)藥物遞送方法的優(yōu)勢。

2、外來體的中心特征是它們能夠在其內(nèi)部空間或腔中含有生物活性有效負(fù)載物。眾所周知，外來體含有內(nèi)源性有效負(fù)載物(包括mrna、mirna、dna、蛋白質(zhì)、碳水化合物和脂質(zhì))，但是引導(dǎo)所需治療性有效負(fù)載物的特異性負(fù)載的能力目前受到限制。外來體可以通過在生產(chǎn)細(xì)胞中過表達(dá)所需的治療性有效負(fù)載物來負(fù)載，但是由于有效負(fù)載物隨機(jī)定位到細(xì)胞外來體加工中心，該負(fù)載的效率通常有限?？商娲兀?jīng)純化的外來體可以通過例如電穿孔來離體負(fù)載。這些方法可能遭受低效率的問題或者受限于小有效負(fù)載物，如sirna。因此，需要適合的方法來產(chǎn)生高度有效和定義明確的負(fù)載外來體，以更好地實(shí)現(xiàn)基于外來體的技術(shù)的治療用途和其他應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的一個(gè)方面涉及負(fù)載用于治療用途的外來體的新方法。具體地，所述方法使用從外來體腔中新鑒定的蛋白質(zhì)標(biāo)記物。具體地，鑒定一組蛋白質(zhì)(例如，豆蔻酰化的富含丙氨酸的蛋白激酶c底物(marcks)；豆蔻?；母缓彼岬牡鞍准っ竎底物樣1(marcksl1)；和腦酸溶性蛋白1(basp1))以在外來體腔中高度富集。此外，basp1氨基末端的短序列已顯示足以將熒光蛋白貨物分子的高效負(fù)載引導(dǎo)至與全長basp1蛋白相同的程度。此片段少于十個(gè)氨基酸，在工程化外來體負(fù)載領(lǐng)域中呈現(xiàn)出顯著的進(jìn)步，并且在無任何額外的離體操作步驟下允許將任何治療性蛋白貨物有效、可重復(fù)地負(fù)載到外來體腔中。與迄今所述的任何其他基因工程方法相比，使用本文所述的融合蛋白負(fù)載外來體產(chǎn)生具有明顯更高的貨物水平的工程化外來體。

2、將從外來體新鑒定的蛋白質(zhì)和肽序列用于本發(fā)明的各種實(shí)施方案中。例如，一些實(shí)施方案涉及通過使外來體蛋白或蛋白質(zhì)片段與治療相關(guān)蛋白質(zhì)綴合來產(chǎn)生融合蛋白并且在外來體腔中產(chǎn)生含有融合蛋白的外來體。治療相關(guān)蛋白的天然全長蛋白或生物活性片段可以通過與富集外來體的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段綴合而被運(yùn)輸?shù)酵鈦眢w腔中。

3、本發(fā)明進(jìn)一步涉及產(chǎn)生或使用腔工程化外來體，該腔工程化外來體被設(shè)計(jì)成用于在外來體腔中更有效地負(fù)載、或用于負(fù)載治療相關(guān)蛋白。例如，外來體腔可以經(jīng)修飾以在腔中含有更高濃度的天然全長外來體蛋白和/或天然外來體蛋白的片段或修飾物的蛋白質(zhì)。

4、本發(fā)明的一些實(shí)施方案涉及一種用于生產(chǎn)這種腔工程化外來體的生產(chǎn)細(xì)胞或一種產(chǎn)生所述生產(chǎn)細(xì)胞的方法。外源多核苷酸可以被暫時(shí)或穩(wěn)定地引入生產(chǎn)細(xì)胞中，以由生產(chǎn)細(xì)胞產(chǎn)生表面工程化外來體。

5、因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種包含靶蛋白的外來體，其中所述靶蛋白的至少一部分由外源序列表達(dá)，并且所述靶蛋白包含marcks、marcksl1、basp1或其片段或修飾物。

6、在一些實(shí)施方案中，所述靶蛋白以比不同外來體中的不同靶蛋白更高的密度存在于所述外來體中，其中所述不同靶蛋白包括常規(guī)外來體蛋白或其變體。在一些實(shí)施方案中，常規(guī)外來體蛋白選自由以下組成的組：cd9、cd63、cd81、pdgfr、gpi錨蛋白、乳凝集素、lamp2、lamp2b及其片段。

7、在一些實(shí)施方案中，外來體由被遺傳修飾以包含所述外源序列的細(xì)胞產(chǎn)生，任選地其中所述細(xì)胞是hek293細(xì)胞。

8、在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞包含含有外源序列的質(zhì)粒。

9、在一些實(shí)施方案中，所述外源序列被插入到位于相對于編碼marcks、marcksl1或basp1的基因組序列的3’或5’的基因組位點(diǎn)中。在一些實(shí)施方案中，所述外源序列被插入到編碼marcks、marcksl1或basp1的基因組序列中。

10、在一些實(shí)施方案中，所述靶蛋白是包含marcks、marcksl1、basp1或其片段和治療性肽的融合蛋白。

11、在一些實(shí)施方案中，治療性肽選自由以下組成的組：天然肽、重組肽、合成肽或至治療性化合物的接頭。在一些實(shí)施方案中，所述治療性化合物選自由以下組成的組：核苷酸、氨基酸、脂質(zhì)、碳水化合物和小分子。在一些實(shí)施方案中，治療性肽是抗體或其片段或修飾物。在一些實(shí)施方案中，治療性肽是酶、配體、受體、轉(zhuǎn)錄因子或其片段或修飾物。在一些實(shí)施方案中，治療性肽是抗微生物肽或其片段或修飾物。

12、在一些實(shí)施方案中，外來體進(jìn)一步包含第二靶蛋白，其中所述第二靶蛋白包含marcks、marcksl1、basp1或其片段。在一些實(shí)施方案中，外來體進(jìn)一步包含第二靶蛋白，其中所述第二靶蛋白包含ptgfrn、bsg、igsf2、igsf3、igsf8、itgb1、itga4、slc3a2、atp轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或其片段。

13、在一些實(shí)施方案中，所述靶蛋白包含(m)(g)(g/a/s)(k/q)(l/f/s/q)(s/a)(k)(k)(seq?id?no:118)的肽。在一些實(shí)施方案中，所述靶蛋白包含(m)(g)(π)(x)(φ/π)(π)(+)(+)的肽，其中每個(gè)括號內(nèi)位置表示氨基酸，并且其中π是選自由(pro、gly、ala、ser)組成的組的任何氨基酸，x是任何氨基酸，φ是選自由(val、ile、leu、phe、trp、tyr、met)組成的組的任何氨基酸，并且(+)是選自由(lys、arg、his)組成的組的任何氨基酸；并且其中位置五不是(+)并且位置六既不是(+)也不是(asp或glu)。在一些實(shí)施方案中，所述靶蛋白包含(m)(g)(π)(ξ)(φ/π)(s/a/g/n)(+)(+)的肽，其中每個(gè)括號內(nèi)位置表示氨基酸，并且其中π是選自由(pro、gly、ala、ser)組成的組的任何氨基酸，ξ是選自由(asn、gln、ser、thr、asp、glu、lys、his、arg)組成的組的任何氨基酸，φ是選自由(val、ile、leu、phe、trp、tyr、met)組成的組的任何氨基酸，并且(+)是選自由(lys、arg、his)組成的組的任何氨基酸；并且其中位置五不是(+)并且位置六既不是(+)也不是(asp或glu)。

14、在一些實(shí)施方案中，靶蛋白包含seq?id?no:4-110中的任一種的肽。在一些實(shí)施方案中，所述靶蛋白包含mgxklskkk的肽，其中x是任何氨基酸(seq?id?no:116)。在一些實(shí)施方案中，靶蛋白包含seq?id?no:110的肽。在一些實(shí)施方案中，靶蛋白包含seq?id?no:13的肽。

15、在一些實(shí)施方案中，靶蛋白進(jìn)一步包含貨物肽。

16、在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種包含外來體和賦形劑的藥物組合物。

17、在一些實(shí)施方案中，藥物組合物基本上不含大分子，其中所述大分子選自核酸、外源蛋白、脂質(zhì)、碳水化合物、代謝物及其組合。

18、在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種產(chǎn)生本文提供的外來體的細(xì)胞群。

19、在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞群包含編碼靶蛋白的外源序列，所述靶蛋白包含marcks、marcksl1、basp1或其片段或修飾物。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞群進(jìn)一步包含編碼第二靶蛋白的第二外源序列，其中所述第二靶蛋白包含marcks、marcksl1、basp1或其片段或修飾物。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞群進(jìn)一步包含編碼第二靶蛋白的第二外源序列，其中所述第二靶蛋白包含ptgfrn、bsg、igsf2、igsf3、igsf8、itgb1、itga4、slc3a2、atp轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或其片段。

20、在一些實(shí)施方案中，外源序列被插入到編碼marcks、marcksl1、或basp1的基因組序列中，其中所述外源序列和所述基因組序列編碼所述靶蛋白。在一些實(shí)施方案中，外源序列是在質(zhì)粒中。

21、在一些實(shí)施方式中，外源序列編碼治療性肽。在一些實(shí)施方案中，治療性肽選自由以下組成的組：天然肽、重組肽、合成肽或至治療性化合物的接頭。在一些實(shí)施方案中，所述治療性化合物選自由以下組成的組：核苷酸、氨基酸、脂質(zhì)、碳水化合物和小分子。在一些實(shí)施方案中，治療性肽是抗體或其片段或修飾物。在一些實(shí)施方案中，治療性肽是酶、配體、受體、轉(zhuǎn)錄因子或其片段或修飾物。在一些實(shí)施方案中，治療性肽是抗微生物肽或其片段或修飾物。

22、在一些實(shí)施方案中，外源序列編碼靶向部分。在一些實(shí)施方案中，靶向部分對器官、組織或細(xì)胞具有特異性。

23、在一些實(shí)施方案中，第二靶蛋白進(jìn)一步包含靶向部分。在一些實(shí)施方案中，靶向部分對器官、組織或細(xì)胞具有特異性。

24、在一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種用于修飾外來體的多肽，其包含以下的序列：(i)(m)(g)(g/a/s)(k/q)(l/f/s/q)(s/a)(k)(k)(seq?id?no:118)；(ii)(m)(g)(π)(x)(φ/π)(π)(+)(+)，其中每個(gè)括號內(nèi)位置表示氨基酸，并且其中π是選自由(pro、gly、ala、ser)組成的組的任何氨基酸，x是任何氨基酸，φ是選自由(val、ile、leu、phe、trp、tyr、met)組成的組的任何氨基酸，并且(+)是選自由(lys、arg、his)組成的組的任何氨基酸；并且其中位置五不是(+)并且位置六既不是(+)也不是(asp或glu)；或(iii)(m)(g)(π)(ξ)(φ/π)(s/a/g/n)(+)(+)，其中每個(gè)括號內(nèi)位置表示氨基酸，并且其中π是選自由(pro、gly、ala、ser)組成的組的任何氨基酸，ξ是選自由(asn、gln、ser、thr、asp、glu、lys、his、arg)組成的組的任何氨基酸，φ是選自由(val、ile、leu、phe、trp、tyr、met)組成的組的任何氨基酸，并且(+)是選自由(lys、arg、his)組成的組的任何氨基酸；并且其中位置五不是(+)并且位置六既不是(+)也不是(asp或glu)。

25、在一些實(shí)施方案中，多肽包含seq?id?no:4-110中的任一種的序列。在一些實(shí)施方案中，多肽包含seq?id?no:13的序列。在一些實(shí)施方案中，多肽包含seq?id?no:110的序列。在一些實(shí)施方案中，多肽包含mgxklskkk的序列，其中x是任何氨基酸(seq?id?no:116)。

26、在一些實(shí)施方案中，多肽與貨物肽融合。在一些實(shí)施方案中，多肽與所述貨物肽的n末端融合。

27、在一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種多核苷酸構(gòu)建體，該多核苷酸構(gòu)建體包含編碼本文提供的多肽的編碼序列。在一些實(shí)施方案中，編碼序列經(jīng)密碼子優(yōu)化。

28、在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供一種制備工程化外來體的方法，其包括以下步驟：a.向細(xì)胞中引入編碼融合多肽的核酸構(gòu)建體，所述融合多肽包含(i)編碼marcks、marcksl1、basp1或其片段或修飾物的第一序列，和(ii)編碼貨物肽的第二序列；b.將所述細(xì)胞維持在允許所述細(xì)胞表達(dá)所述融合多肽的條件下；和c.從所述細(xì)胞獲得包含所述融合多肽的工程化外來體。

29、在一些實(shí)施方案中，第一序列包含以下的序列：(i)(m)(g)(g/a/s)(k/q)(l/f/s/q)(s/a)(k)(k)(seq?id?no:118)；(ii)m)(g)(π)(x)(φ/π)(π)(+)(+)，其中每個(gè)括號內(nèi)位置表示氨基酸，并且其中π是選自由(pro、gly、ala、ser)組成的組的任何氨基酸，x是任何氨基酸，φ是選自由(val、ile、leu、phe、trp、tyr、met)組成的組的任何氨基酸，并且(+)是選自由(lys、arg、his)組成的組的任何氨基酸；并且其中位置五不是(+)并且位置六既不是(+)也不是(asp或glu)；或(iii)(m)(g)(π)(ξ)(φ/π)(s/a/g/n)(+)(+)，其中每個(gè)括號內(nèi)位置表示氨基酸，并且其中π是選自由(pro、gly、ala、ser)組成的組的任何氨基酸，ξ是選自由(asn、gln、ser、thr、asp、glu、lys、his、arg)組成的組的任何氨基酸，φ是選自由(val、ile、leu、phe、trp、tyr、met)組成的組的任何氨基酸，并且(+)是選自由(lys、arg、his)組成的組的任何氨基酸；并且其中位置五不是(+)并且位置六既不是(+)也不是(asp或glu)。

30、在一些實(shí)施方案中，多核苷酸包含seq?id?no:4-110中的任一種的序列。在一些實(shí)施方案中，多核苷酸包含seq?id?no:13的序列。在一些實(shí)施方案中，多核苷酸包含seq?idno:110的序列。在一些實(shí)施方案中，多核苷酸包含mgxklskkk的序列，其中x是任何氨基酸(seq?id?no:116)。

31、在一些實(shí)施方案中，融合多肽以比不同外來體中的不同靶蛋白更高的密度存在于所述工程化外來體的腔中，其中所述不同靶蛋白包括常規(guī)外來體蛋白或其變體。在一些實(shí)施方案中，融合多肽以比不同外來體中的不同靶蛋白高超過2倍的密度存在。在一些實(shí)施方案中，融合多肽以比不同外來體中的不同靶蛋白高超過4倍、16倍、100倍、或10,000倍的密度存在。