本發(fā)明屬于生物醫(yī)用材料領(lǐng)域，具體涉及一種溫敏水凝膠與富血小板血漿復(fù)合物及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、羥丁基殼聚糖是近十余年發(fā)展起來的新型溫敏型生物材料，具有良好的生物相容性、可降解性。羥丁基殼聚糖的水溶液在低溫下(低于其凝膠溫度)為溶液狀態(tài)，逐漸升溫后，可在高于其凝膠溫度后，如達(dá)到體溫37℃后轉(zhuǎn)變?yōu)椴荒芰鲃拥哪z狀態(tài)。這一特性使得該材料作用于病患部位后，可以長期固定并發(fā)揮作用。羥丁基殼聚糖溫敏水凝膠可以使用在幾乎任何形狀的創(chuàng)面，包括平面型、褶皺型、縫隙型等，使用后轉(zhuǎn)變?yōu)椴涣鲃拥哪z貼附在創(chuàng)面上，不會因體位改變而流失，從而起到長期治療的效果，解決了其他液體凝膠材料流動性大，易離開需要屏障的創(chuàng)面部位的問題。

2、富血小板血漿(prp)是將人體自體血液經(jīng)過離心分離后獲得的富含血小板的血漿部分，富含生長因子，可以用來治療骨折、骨關(guān)節(jié)炎、慢性創(chuàng)面、美容填充等多種疾病。prp在臨床應(yīng)用過程中，經(jīng)常面臨在創(chuàng)面隨重力流走，不能長時(shí)間停留的問題，這樣導(dǎo)致不能起到應(yīng)有的治療效果。而且prp停留在創(chuàng)面上時(shí)，其內(nèi)部的血小板容易被激活，其中的生長因子在短時(shí)間內(nèi)大量釋放，其中只有極少部分發(fā)揮作用，大部分被傷口中的酶水解，作用時(shí)間不夠長久。

3、公布號為cn116785235?a的發(fā)明專利公開了一種羥丁基殼聚糖與富血小板血漿藥物緩釋溫敏水凝膠，其將羥丁基殼聚糖與富血小板血漿按照不低于2:1的比例混合，在接近體溫條件下形成凝膠態(tài)，從而降低治療頻次提高prp的使用效率。

4、但公布號為cn113908329?a的中國發(fā)明專利申請公開的一種羥丁基殼聚糖水凝膠敷料及其制備方法，其中發(fā)現(xiàn)氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、氯化鎂、硝酸鉀、硫酸鈉等藥典中常用的強(qiáng)極性的離子型滲透壓調(diào)節(jié)劑在常規(guī)條件下不能用于與羥丁基殼聚糖制劑進(jìn)行配伍。這是由于羥丁基殼聚糖與上述強(qiáng)極性物質(zhì)配伍，在低溫為均一透明的流動溶液，而在升溫時(shí)變?yōu)榘咨煌该鞯哪z，凝膠強(qiáng)度較低，在外力作用下很容易散碎，且不會再次凝固，除非重新在低溫使其均一化。

5、這一特點(diǎn)使羥丁基殼聚糖水凝膠與含等滲鹽濃度的生物活性材料如富血小板血漿(prp)、外泌體、細(xì)胞培養(yǎng)基等都不能以大比例混合，否則會產(chǎn)生析出，導(dǎo)致羥丁基殼聚糖失去凝膠性質(zhì)，從而限制了羥丁基殼聚糖在上述領(lǐng)域的應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對上述問題，本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種改性羥丁基殼聚糖溫敏水凝膠與富血小板血漿復(fù)合物，該復(fù)合物體溫下能轉(zhuǎn)變?yōu)椴涣鲃拥哪z、且能較長時(shí)間保持凝膠狀態(tài)，實(shí)現(xiàn)血小板內(nèi)的生長因子逐步釋放，發(fā)揮長期的作用效果，可用于用于人體自身細(xì)胞的培養(yǎng)、作為體表淺層及深層組織或體內(nèi)植入材料。

2、本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種上述溫敏水凝膠與富血小板血漿復(fù)合物的制備方法，及其在制備創(chuàng)面修復(fù)材料、軟組織修復(fù)材料、軟骨修復(fù)材料、骨修復(fù)材料、肌腱修復(fù)材料、骨關(guān)節(jié)炎材料、美容填充材料的應(yīng)用。

3、本發(fā)明的溫敏水凝膠與富血小板血漿復(fù)合物，由溫敏水凝膠溶液與富血小板血漿按比例在2-8℃混合均勻而成，所述溫敏水凝膠與富血小板血漿的質(zhì)量比為：(0.25-100)：1，該復(fù)合物在升溫至接近體溫時(shí)轉(zhuǎn)變?yōu)槟z。所述溫敏水凝膠溶液包含質(zhì)量百分濃度為0.5％-10％陰離子基團(tuán)取代羥丁基殼聚糖，滲透壓調(diào)節(jié)劑：0.1-10％；水：余量。

4、上述溫敏水凝膠與富血小板血漿復(fù)合物的制備方法，包括以下步驟：

5、(1)將陰離子基團(tuán)取代羥丁基殼聚糖在2℃-8℃溶解于滲透壓調(diào)節(jié)劑中，得到質(zhì)量百分濃度為0.5％-10％的溫敏水凝膠溶液；

6、(2)稱取上述溫敏水凝膠溶液和富血小板血漿，在2℃-8℃下混合，搖勻，升溫至37℃或植入填充部位，得到凝固的溫敏水凝膠/富血小板血漿復(fù)合物。

7、步驟(1)的溫敏水凝膠溶液與富血小板血漿混合前還經(jīng)過濕熱滅菌或輻射滅菌后獲得無菌的溫敏水凝膠的步驟。

8、所述滲透壓調(diào)節(jié)劑為甘油、甘露醇等多元醇，或氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、氯化鎂、硝酸鉀、硫酸鈉、磷酸鹽緩沖液等強(qiáng)極性離子型化合物中的一種或多種。

9、本發(fā)明的陰離子基團(tuán)取代羥丁基殼聚糖溫敏水凝膠與上述滲透壓調(diào)節(jié)劑配伍時(shí)能夠獲得均一的溶液，特別時(shí)以強(qiáng)極性的離子型化合物(如氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、氯化鎂、硝酸鉀、硫酸鈉、磷酸鹽緩沖液等)的滲透壓調(diào)節(jié)劑配伍下，能獲得性能良好的溫敏性溶液，且在體溫下形成凝膠時(shí)也呈現(xiàn)均一，透明的狀態(tài)，凝膠強(qiáng)度大，不存在變白及散碎的問題，可與人體生理環(huán)境良好匹配，同時(shí)還與細(xì)胞培養(yǎng)液有良好的相容性，可作為細(xì)胞載體，是效果更優(yōu)良的具有溫敏性的細(xì)胞載體。

10、所述陰離子基團(tuán)取代羥丁基殼聚糖衍生物，具有如下結(jié)構(gòu)：

11、

12、其中，r1、r2、r3、r4為下列基團(tuán)之一：

13、h，羥丁基，陰離子基團(tuán)，乙酰基。

14、所述陰離子基團(tuán)為：羧甲基，羧乙基，甲基羧甲基，羧丙基，2-羧基丙基，1,3-二羧基丙基，羧丁基，3-羧基丁基，2-羧甲基丙基，磺酸基，磺酸丙基，2-羥基磺酸丙基，以及羥丁基上的氫原子被上述離子基團(tuán)取代后形成的基團(tuán)。

15、優(yōu)選的，陰離子基團(tuán)取代羥丁基殼聚糖為羧甲基羥丁基殼聚糖、乙?；燃谆u丁基殼聚糖、丙?；燃谆u丁基殼聚糖。

16、所述基團(tuán)的結(jié)構(gòu)式如下：

17、羥丁基：ch3ch2chohch2-；乙?；呼燃谆?ch2cooh；羧乙基：-ch2ch2cooh；甲基羧甲基：羧丙基：-ch2ch2ch2cooh；2-羧基丙基：1,3-二羧基丙基：羧丁基：-ch2ch2ch2ch2cooh；3-羧基丁基：2-羧甲基丙基：磺酸基：-so3h；磺酸丙基：-ch2ch2ch2so3h；2-羥基磺酸丙基：2-羧甲氧基丁基：2-羧乙氧基丁基：

18、所述羥丁基的取代度為1.0-4.0；陰離子基團(tuán)取代度為0.1-3.0。

19、優(yōu)選的羥丁基的取代度為1.5-3.0；陰離子基團(tuán)取代度為0.2-2.0。

20、本發(fā)明的陰離子基團(tuán)取代羥丁基殼聚糖衍生物通過以下方法制備而成：

21、方法一：先對殼聚糖進(jìn)行陰離子基團(tuán)改性，得到陰離子改性殼聚糖，再進(jìn)行羥丁基化改性，得到含陰離子基團(tuán)取代的羥丁基殼聚糖衍生物，再進(jìn)行?；男缘玫阶罱K的陰離子基團(tuán)取代羥丁基殼聚糖衍生物。

22、方法二：先對殼聚糖進(jìn)行羥丁基化改性，得到羥丁基取代的殼聚糖；再對羥丁基殼聚糖進(jìn)行陰離子基團(tuán)改性，得到含陰離子基團(tuán)取代的羥丁基殼聚糖衍生物，也可再經(jīng)?；男缘玫阶罱K的陰離子基團(tuán)取代羥丁基殼聚糖衍生物。

23、方法三：先對殼聚糖進(jìn)行羥丁基化改性，得到羥丁基取代的殼聚糖；再經(jīng)?；男缘玫锦；u丁基殼聚糖衍生物，再進(jìn)行陰離子基團(tuán)改性，得到最終的陰離子基團(tuán)取代羥丁基殼聚糖衍生物。

24、反應(yīng)體系中的溶劑為水、氫氧化鈉溶液、氫氧化鉀溶液、尿素溶液、鹽酸胍溶液、鹽酸、硝酸、甲醇、甲酸、乙醇、乙酸、乙腈、正丙醇、異丙醇、正丁醇、丙酮、二甲基亞砜、n-甲基吡咯烷酮、n,n-二甲基甲酰胺、n,n-二甲基乙酰胺、二氧六環(huán)中的一種或多種的組合。

25、上述接枝反應(yīng)的類型包括親核取代反應(yīng)、席夫堿反應(yīng)、邁克爾加成反應(yīng)和開環(huán)反應(yīng)。

26、親核取代反應(yīng)的試劑包括：氯乙酸、3-氯丙酸、2-氯丙酸、4-氯丁酸、2-甲基-2-氯丙酸、5-氯丁酸、2-甲基-4-氯丙酸、氯磺酸、3-氯丙磺酸鈉、3-氯-2-羥基丙磺酸鈉。

27、席夫堿反應(yīng)試劑包括：乙醛酸、丙酮酸、α-酮戊二酸；所述還原劑包括：硼氫化鈉、氫化鋁鋰、硼氫化鋰、硼氫化鉀、氰基硼氫化鈉、硼烷氨等。

28、邁克爾加成反應(yīng)試劑包括：丙烯酸、甲基丙烯酸。

29、開環(huán)反應(yīng)試劑包括：2,3-環(huán)氧丙磺酸鈉、丙磺酸內(nèi)酯。

30、席夫堿反應(yīng)的ph值范圍為3-7，還原反應(yīng)的ph值范圍為8-14。

31、邁克爾加成反應(yīng)的ph值范圍為3-7。

32、開環(huán)反應(yīng)的ph值在使用試劑丙磺酸內(nèi)酯時(shí)范圍為0-5；在使用試劑2,3-環(huán)氧丙磺酸鈉時(shí)范圍為7-14。

33、使用酸或堿調(diào)節(jié)反應(yīng)體系ph值。所述堿為氫氧化鈉或氫氧化鉀，堿溶液的摩爾濃度為0.01-15mol/l。所述酸為鹽酸、硫酸、乙酸，所述酸的濃度為0.01-18.4mol/l。

34、反應(yīng)溫度為0℃-70℃；所述反應(yīng)時(shí)間為0.5h-120h。

35、本發(fā)明還提供了上述溫敏水凝膠與富血小板血漿復(fù)合物的應(yīng)用：按照上述方法制備的溫敏水凝膠與富血小板血漿復(fù)合物，用于制備創(chuàng)面修復(fù)材料、軟組織修復(fù)材料、軟骨修復(fù)材料、骨修復(fù)材料、肌腱修復(fù)材料、骨關(guān)節(jié)炎材料、美容填充材料的應(yīng)用。

36、本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：

37、1.本發(fā)明的溫敏水凝膠/富血小板血漿復(fù)合物為均勻的凝膠，具有溫度敏感性，即低溫為具有流動性的溶液，體溫轉(zhuǎn)變?yōu)椴涣鲃拥哪z，在兩種狀態(tài)下均為均相，不存在明顯的沉淀，體溫下即便在大量pbs溶液浸泡下，仍能較長時(shí)間保持凝膠狀態(tài)。

38、2.本發(fā)明的溫敏水凝膠/富血小板血漿復(fù)合物里的血小板內(nèi)的生長因子可逐步向凝膠外釋放，發(fā)揮長期的作用效果。

39、3.本發(fā)明的溫敏水凝膠/富血小板血漿復(fù)合物，由于使用自身的血液提取富血小板血漿，可以用于培養(yǎng)人體自身的細(xì)胞，用于各種細(xì)胞治療相關(guān)的疾病。

40、4.本發(fā)明的溫敏水凝膠/富血小板血漿復(fù)合物，可用于體表淺層、體表深層組織或體內(nèi)植入使用。可用于急、慢性創(chuàng)面護(hù)理，各種軟組織修復(fù)、軟骨修復(fù)、肌腱修復(fù)、骨修復(fù)等。也可以作為各種藥物或細(xì)胞的載體、組織工程支架材料。