本發(fā)明涉及水凝膠敷料材料的制備和應(yīng)用領(lǐng)域，尤其涉及一種用于機(jī)器學(xué)習(xí)輔助的比率熒光傳感肽水凝膠及其制備方法。

背景技術(shù)：

1、由于高血糖和新陳代謝失調(diào)，糖尿病慢性傷口的炎癥管理仍然是一項重大的臨床挑戰(zhàn)。正常傷口愈合過程通常分為四個連續(xù)階段：止血期、炎癥期、增殖期和重塑期。在炎癥階段，炎癥細(xì)胞會清除傷口部位的壞死組織和碎屑，為隨后的增殖階段創(chuàng)造條件。然而在糖尿病慢性創(chuàng)面中，持續(xù)的高血糖狀態(tài)和代謝紊亂會導(dǎo)致炎癥反應(yīng)持續(xù)遷延，形成病理性炎癥微環(huán)境。因此，有效調(diào)控炎癥反應(yīng)對于促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面愈合、降低感染風(fēng)險及預(yù)防全身并發(fā)癥具有重要臨床意義。在炎癥狀態(tài)下，炎癥細(xì)胞，尤其是中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，會通過nadph氧化酶介導(dǎo)的超氧陰離子（o2-）生成活性氧（ros）；同時，促炎細(xì)胞因子（如tnf-α和il-1β）的分泌會觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)信號級聯(lián)，使細(xì)胞膜鈣水平升高，從而激活鈣依賴性蛋白激酶，繼而誘導(dǎo)ros的形成。而且研究發(fā)現(xiàn)ros水平與炎癥狀態(tài)呈正相關(guān)，ros可作為評估慢性傷口炎癥狀態(tài)的生物標(biāo)志物。

2、在臨床上，通常使用熒光專用探針（如dcfh-da、luminol）或電子自旋共振（esr）技術(shù)對ros水平進(jìn)行量化。檢測過程包括樣本采集、處理、檢測和數(shù)據(jù)分析，耗時較長，而且難以在傷口部位原位實時監(jiān)測ros水平。目前已開發(fā)出多種ros熒光探針，主要是利用改性熒光團(tuán)來靶向ros。然而大多數(shù)基于熒光的ros檢測方法也需要取樣、檢測和分析，無法用于實時檢測。此外，由于微環(huán)境固有的復(fù)雜性，建立適用于原位傷口監(jiān)測的基于強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)曲線具有挑戰(zhàn)性。與基于熒光強(qiáng)度的方法相比，比率熒光方法依賴顏色變化，具有抗干擾能力和高靈敏度。此外多肽具有生物相容性、可調(diào)生物降解性、化學(xué)多樣性和可編程生物活性，在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用方面具有巨大潛力。最近的研究進(jìn)展擴(kuò)大了多肽在抗感染治療和炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)方面的應(yīng)用，尤其是在慢性傷口和炎癥治療方面。因此，有必要開發(fā)基于多肽原位比率熒光材料，以應(yīng)對慢性糖尿病傷口復(fù)雜環(huán)境帶來的挑戰(zhàn)，從而實現(xiàn)對傷口炎癥的實時監(jiān)測，并為指導(dǎo)治療方案的調(diào)整提供有價值的數(shù)據(jù)。但是國內(nèi)外尚沒有發(fā)現(xiàn)關(guān)于制備比率熒光傳感肽水凝膠應(yīng)用于實時監(jiān)測糖尿病慢性傷口炎癥的技術(shù)方案。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提出一種用于機(jī)器學(xué)習(xí)輔助，從而可以實時監(jiān)測炎癥的比率熒光傳感肽水凝膠及其制備方法。

2、為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提出一種比率熒光傳感肽水凝膠，比率熒光傳感肽水凝膠由修飾了不同熒光分子的改性聚賴氨酸與聚谷氨酸交聯(lián)所得。

3、進(jìn)一步的，熒光分子為香豆素7和四苯基乙烯；修飾了不同熒光分子的改性聚賴氨酸為plys-tk-c7和plys-tk-tpe。

4、進(jìn)一步的，修飾了不同熒光分子的改性聚賴氨酸通過將熒光分子、ros響應(yīng)基團(tuán)tk-2cooh和edci溶解于適量的dmso中，隨后加入三乙胺和dmpa，反應(yīng)一段時間后，加入聚賴氨酸，edci，三乙胺和dmpa，反應(yīng)結(jié)束后，加入適量的丙酮進(jìn)行沉淀，得到油狀沉淀物，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除剩余的有機(jī)試劑后獲得。

5、本發(fā)明還提出一種制備比率熒光傳感肽水凝膠的方法，基于n6-cbz-l-賴氨酸和l-谷氨酸-5-芐酯原材料制備比率熒光傳感肽水凝膠，?包括以下步驟：

6、s1：將n6-cbz-l-賴氨酸和α-蒎烯溶于無水thf中，加熱，攪拌后將反應(yīng)液倒入正己烷中，析出黃色固體，干燥，得到(s)-(4-(2,5-二氧代惡唑烷-4-基)丁基)氨基甲酸芐酯，即lys-nca；

7、s2：將l-谷氨酸-5-芐酯和α-蒎烯溶于無水thf中，加熱，攪拌后將反應(yīng)液倒入正己烷中，析出淡黃色固體，干燥，得到(s)-3-(2,5-二氧代惡唑烷-4-基)丙酸芐酯，即glu-nca；

8、s3：將lys-nca和glu-nca分別溶于無水dmf中，隨后均加入正己胺/無水dmf溶液，在負(fù)壓條件下反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液倒入無水乙醚中，離心，減壓干燥，得到帶保護(hù)基團(tuán)的聚賴氨酸和帶保護(hù)基團(tuán)的聚谷氨酸；

9、s4：將帶保護(hù)基團(tuán)的聚賴氨酸和帶保護(hù)基團(tuán)的聚谷氨酸分別溶解在tfa中，然后均滴加質(zhì)量比為30%的溴化氫乙酸溶液，密封攪拌，反應(yīng)結(jié)束后加入丙酮沉淀，離心，并用丙酮洗滌2-3次，直至上清液呈無色，透析后冷凍干燥后的聚賴氨酸和聚谷氨酸；

10、s5：將熒光分子tpe-nh2和熒光分子c7，分別與活性氧響應(yīng)基團(tuán)雙羧基酮縮硫醇和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽溶解于適量的dmso中，隨后加入三乙胺和n,n-二甲基丙烯酰胺，反應(yīng)一段時間后，繼續(xù)加入聚賴氨酸、edci、三乙胺和dmpa，反應(yīng)結(jié)束后，加入適量的丙酮進(jìn)行沉淀，得到油狀沉淀物，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除剩余的有機(jī)試劑，得到固體聚合物plys-tk-tpe和plys-tk-c7；

11、s6：將聚谷氨酸、plys-tk-tpe和plys-tk-c7分別溶于dmso中，分別得到pglu/dmso、ply-tpe/dmso和ply-c7/dmso溶液，并將三份溶液混合，再加入edci，混合物迅速充分混合，然后倒入模具中，得水凝膠，并將其與模具一起放入去離子水中透析，最終大部分水凝膠留在模具中。

12、進(jìn)一步的，步驟s1中，反應(yīng)溫度為55℃，攪拌時間為45min，干燥溫度為40℃，干燥時間為12h。

13、進(jìn)一步的，步驟s2中，反應(yīng)溫度為55℃，攪拌時間為3h，干燥溫度為40℃，干燥時間為12h。

14、進(jìn)一步的，在步驟s3中，反應(yīng)在無水條件下進(jìn)行，攪拌時間為48h，lys-nca和glu-nca均為1/200，無水乙醚的體積為反應(yīng)液的15倍。

15、進(jìn)一步的，在步驟s4中，反應(yīng)溫度為25℃，攪拌時間為2h，丙酮的體積量為反應(yīng)液的五倍。

16、進(jìn)一步的，在步驟s5中，熒光分子c7:?tk-2cooh:?dmpa的摩爾比為：1:1:2.5；

17、熒光分子c7:三乙胺:dmpa的摩爾比為：1:2.5:2.5，反應(yīng)溫度為25℃，攪拌時間為3h；

18、熒光分子tpe-nh2/聚賴氨酸/edci/三乙胺/dmpa的摩爾比為：1:55:1:1:1，反應(yīng)溫度為25℃，攪拌時間為12?h。

19、進(jìn)一步的，在步驟s6中，pglu/dmso、ply-tpe/dmso和ply-c7/dmso溶液的混合摩爾比例為2：1：1；

20、edci的量為賴氨酸總摩爾數(shù)的30%；透析時間為12?h。

21、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)勢之處在于：

22、（1）本發(fā)明的比率熒光傳感肽水凝膠不僅能夠能按比率監(jiān)測炎癥狀態(tài)還能夠促進(jìn)傷口愈合，在糖尿病慢性傷口的治療領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價值。

23、（2）本發(fā)明的比率熒光傳感肽水凝膠監(jiān)測炎癥狀態(tài)主要依賴顏色變化，與基于熒光強(qiáng)度的方法相比，具有更強(qiáng)的抗干擾能力和高靈敏度。

24、（3）本發(fā)明制備得到的比率熒光傳感肽水凝膠，具有良好的水溶性、生物相容性。

25、（4）本發(fā)明簡單，實驗條件溫和，易操作。