本發(fā)明屬于生物化學(xué)，具體涉及一種生物素標(biāo)記的小分子物質(zhì)及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、常見的酶聯(lián)免疫檢測方法(enzyme?linked?immunosorbent?assay，elisa)實驗方法包括競爭法、捕獲法、間接法、夾心法。競爭法可用于測定抗原，也可用于測定抗體；以測定抗原為例，受檢抗原和酶標(biāo)抗原競爭與固相抗體結(jié)合，因此結(jié)合于固相的酶標(biāo)抗原量與受檢抗原的量呈反比；該方法一般用來檢測具有較少表位的小分子物質(zhì)。

2、光激化學(xué)發(fā)光法(light?initiated?chemiluminescent?assay)是一種均相免疫檢測技術(shù)，屬于化學(xué)發(fā)光分析技術(shù)的常用方法之一，可用于研究生物分子間的相互作用，臨床上主要用于疾病的檢測。該技術(shù)整合了高分子微粒技術(shù)、有機合成、蛋白質(zhì)化學(xué)及臨床檢測等相關(guān)領(lǐng)域的研究。它通過感光微粒和發(fā)光微粒在一定范圍內(nèi)結(jié)合，產(chǎn)生離子氧能量的傳遞，發(fā)出光信號，從而對待測樣本進行檢測。其中，感光微粒內(nèi)部填充有感光化合物，而發(fā)光微粒內(nèi)部填充有發(fā)光化合物和鑭系元素。在紅色激光(600～700nm)的激發(fā)下，感光微粒釋放出高能態(tài)的單線態(tài)氧離子(4μs)，其傳播距離約為200nm。當(dāng)感光微粒和發(fā)光微粒的距離足夠接近時，感光微粒釋放的單線態(tài)氧離子能到達發(fā)光微粒，并通過一系列的化學(xué)反應(yīng)，發(fā)射出520～620nm高能級的光，而被儀器檢測到。在光激化學(xué)發(fā)光免疫檢測反應(yīng)體系中，微粒的濃度很低，碰撞幾率較小，本底信號微弱。只有在感光微粒和發(fā)光微粒通過免疫反應(yīng)結(jié)合以后，才會發(fā)射出明顯的光，因此檢測的靈敏度很高。與傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫分析方法相比，它具有均相、靈敏度高和操作簡便易于自動化等特點。因此，其應(yīng)用前景十分廣闊。

3、光激化學(xué)發(fā)光法檢測是基于特異性配對結(jié)合來捕獲目標(biāo)分子并使其發(fā)出信號后進行檢測的，當(dāng)將該方法用于檢測小分子物質(zhì)時，由于小分子物質(zhì)本身分子量較小，采用常見的方法進行生物素標(biāo)記后分子量依然較小，檢測信號值和區(qū)分度較低；而且，標(biāo)記前后兩種物質(zhì)的分子量相差較小，導(dǎo)致常規(guī)的透析純化難以進行，難以獲得較為純凈的生物素標(biāo)記物，制備檢測所用的試劑時需要加入更多含生物素標(biāo)記物的混合物，引入的雜質(zhì)也較多，容易對正常檢測產(chǎn)生干擾，從而導(dǎo)致檢測信號值和區(qū)分度較低。因此，急需開發(fā)一種能基于競爭法的原理應(yīng)用于光激化學(xué)發(fā)光免疫檢測中對分子量較小的物質(zhì)進行檢測并獲得較高的信號值和區(qū)分度的競爭物。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種生物素標(biāo)記的小分子物質(zhì)及其制備方法和應(yīng)用，將本發(fā)明的生物素標(biāo)記的小分子物質(zhì)應(yīng)用于光激化學(xué)發(fā)光免疫檢測中對分子量較小的物質(zhì)進行檢測具有較高的信號值和區(qū)分度。

2、為此，本發(fā)明第一方面提供了一種生物素標(biāo)記的小分子物質(zhì)，所述生物素通過長鏈分子標(biāo)記所述小分子物質(zhì)；所述長鏈分子的分子量不低于1000da，所述小分子物質(zhì)的分子量低于1000da。

3、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述生物素標(biāo)記的小分子物質(zhì)的分子量為1500da～20000da，優(yōu)選為2000da～16000da，更優(yōu)選為3000da～11000da，進一步優(yōu)選為4000da～6000da。例如，所述生物素標(biāo)記的小分子物質(zhì)的分子量可以為4000da、4063da、4500da、5000da、5500da、6000da等。

4、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述長鏈分子的分子量為1000da～19000da，優(yōu)選為1500da～15000da，更優(yōu)選為2000da～10000da，進一步優(yōu)選為3000da～5000da。

5、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述長鏈分子為親水性長鏈聚合物分子。

6、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述長鏈分子選自聚乙二醇或葡聚糖。

7、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述聚乙二醇選自peg25～peg200中的至少一種；優(yōu)選地，選自peg30～peg180中的至少一種；更優(yōu)選地，選自peg40～peg150中的至少一種；進一步優(yōu)選地，選自peg70～peg120中的至少一種。

8、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述葡聚糖[c6h10o5]n選自n＝7～55的葡聚糖中的至少一種；優(yōu)選地，選自n＝10～50的葡聚糖中的至少一種；更優(yōu)選地，選自n＝16～40的葡聚糖中的至少一種；進一步優(yōu)選地，選自n＝20～30的葡聚糖中的至少一種。

9、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述小分子物質(zhì)的分子量小于800da，更優(yōu)選為小于600da。

10、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述小分子物質(zhì)能與特異性配對結(jié)合成員發(fā)生特異性配對結(jié)合；優(yōu)選地，所述特異性配對結(jié)合成員還能與待檢測目標(biāo)分子發(fā)生特異性配對結(jié)合；更優(yōu)選地，所述待檢測目標(biāo)分子與所述特異性配對結(jié)合成員發(fā)生特異性配對結(jié)合時具有比所述生物素標(biāo)記的小分子物質(zhì)更強的結(jié)合力。

11、本發(fā)明第二方面提供了一種如第一方面所述的生物素標(biāo)記的小分子物質(zhì)的制備方法，包括如下步驟：

12、(1)采用dss對所述小分子物質(zhì)進行活化，獲得小分子物質(zhì)-lc-nhs；

13、(2)將步驟(1)獲得的小分子物質(zhì)-lc-nhs與生物素-長鏈分子-nhs混合反應(yīng)，獲得含生物素標(biāo)記的小分子物質(zhì)的混合物；

14、(3)采用脫鹽柱對步驟(2)獲得的含生物素標(biāo)記的小分子物質(zhì)的混合物進行脫鹽純化。

15、在本發(fā)明的一些實施方式中，步驟(2)中，小分子物質(zhì)-lc-nhs的物質(zhì)的量大于或等于生物素-長鏈分子-nhs的物質(zhì)的量。

16、在本發(fā)明的一些實施方式中，步驟(2)中，脫鹽純化進行多次，如2～5次。

17、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述脫鹽柱對分子量小于1000da的物質(zhì)的滯留效率≥95％。

18、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述脫鹽柱為zeba脫鹽柱。

19、在本發(fā)明的一些實施方式中，步驟(3)中脫鹽純化使用ph＝8.5、0.1m的nahco3緩沖液進行洗脫。

20、本發(fā)明第三方面提供了一種如第一方面所述的生物素標(biāo)記的小分子物質(zhì)或者如第二方面所述的制備方法制備得到的生物素標(biāo)記的小分子物質(zhì)在光激化學(xué)發(fā)光免疫檢測樣本中是否含有待檢測目標(biāo)分子中的應(yīng)用或在光激化學(xué)發(fā)光免疫檢測樣本中待檢測目標(biāo)分子的濃度中的應(yīng)用。

21、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述待檢測目標(biāo)分子和所述小分子物質(zhì)均能與所述特異性配對結(jié)合成員發(fā)生特異性配對結(jié)合，且所述待檢測目標(biāo)分子與所述特異性配對結(jié)合成員的特異性配對結(jié)合力更強。

22、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述待檢測目標(biāo)分子的分子量小于1000da。

23、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述待檢測目標(biāo)分子為半抗原。

24、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述待檢測目標(biāo)分子選自激素。

25、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述待檢測目標(biāo)分子選自游離四碘甲狀腺素(ft4，分子量為776.93)、四碘甲狀腺素(t4，分子量為776.93)、三碘甲腺原氨酸(t3，分子量為650.97)、游離三碘甲腺原氨酸(ft3，分子量為650.97)、孕酮(prog，分子量為314.46)、睪酮(testo，分子量為288.42)、雌二醇(e2，分子量為274.39)等中任意一種。

26、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述待檢測目標(biāo)分子是游離四碘甲狀腺素，所述小分子物質(zhì)是游離三碘甲腺原氨酸，所述特異性配對結(jié)合成員是四碘甲狀腺素抗體。

27、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述待檢測目標(biāo)分子是四碘甲狀腺素，所述小分子物質(zhì)是三碘甲腺原氨酸，所述特異性配對結(jié)合成員是四碘甲狀腺素抗體。

28、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述待檢測目標(biāo)分子是游離三碘甲腺原氨酸，所述小分子物質(zhì)是游離3,5-二碘-l-甲狀腺素，所述特異性配對結(jié)合成員是三碘甲腺原氨酸抗體。

29、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述待檢測目標(biāo)分子是三碘甲腺原氨酸，所述小分子物質(zhì)是3,5-二碘-l-甲狀腺素，所述特異性配對結(jié)合成員是三碘甲腺原氨酸抗體。

30、本發(fā)明的有益效果為：

31、本發(fā)明提供了一種生物素通過長鏈分子標(biāo)記的小分子物質(zhì)，該標(biāo)記物分子量較大，當(dāng)小分子物質(zhì)與特異性配對結(jié)合成員發(fā)生特異性配對結(jié)合時所形成的特異性配對結(jié)合物分子量也較大，能有效克服現(xiàn)有技術(shù)中因為特異性配對結(jié)合物分子量小而造成的檢測信號值和區(qū)分度低的缺陷。其次，生物素和小分子物質(zhì)之間的長鏈分子增大了小分子物質(zhì)與生物素之間的距離，能有效降低特異性配對結(jié)合成員與小分子物質(zhì)之間進行特異性配對結(jié)合的位阻，從而提高特異性配對結(jié)合成員與小分子物質(zhì)之間特異性配對結(jié)合的成功率，使檢測到的信號值增大、含待檢測目標(biāo)分子的樣本與不含待檢測目標(biāo)分子的樣本的區(qū)分度增大；最終使得檢測的靈敏度和準(zhǔn)確性得到提升。

32、本發(fā)明的長鏈分子選自親水性長鏈聚合物分子，首先，親水性可以滿足生物素在水相中標(biāo)記小分子物質(zhì)的要求；其次，長鏈聚合物分子的分子量比較容易控制，可以根據(jù)檢測的需要選取不同分子量的長鏈聚合物分子制備生物素標(biāo)記的小分子物質(zhì)。親水性長鏈聚合物分子優(yōu)選選自聚乙二醇或葡聚糖，不同分子量的聚乙二醇、葡聚糖獲取方法簡單、成本低，可以根據(jù)所選擇的小分子物質(zhì)的分子量靈活地選擇不同分子量的聚乙二醇、葡聚糖形成分子量合適的生物素標(biāo)記的小分子物質(zhì)，以保證特異性配對結(jié)合物的光激化學(xué)發(fā)光免疫檢測具有較高的準(zhǔn)確度和靈敏度。

33、在本發(fā)明中限定了長鏈分子的分子量不低于1000da，所述小分子物質(zhì)的分子量低于1000da；生物素通過該長鏈分子標(biāo)記的小分子物質(zhì)的分子量與游離的生物素、未標(biāo)記的小分子物質(zhì)的分子量存在較大的差別，在制備本發(fā)明的目標(biāo)標(biāo)記物時，有利于通過簡單的脫鹽純化步驟將游離的生物素、未標(biāo)記的小分子物質(zhì)從制備得到的混合物中分離出去，從而得到高純度的目標(biāo)標(biāo)記物并降低游離的生物素、未標(biāo)記的小分子物質(zhì)對于檢測結(jié)果的干擾。常規(guī)脫鹽柱對于鹽和小分子(分子量小于1000da)的滯留效率≥95％，而分子量稍大于1000da的物質(zhì)也容易被滯留在脫鹽柱中；本發(fā)明的生物素標(biāo)記的小分子物質(zhì)的分子量為1500da～20000da，遠大于1000da，當(dāng)使用脫鹽柱進行脫鹽純化時不容易被滯留在脫鹽柱中，因而，生物素標(biāo)記的小分子物質(zhì)的脫鹽純化收率也較高。

34、另外，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在一定范圍內(nèi)，適當(dāng)增大長鏈分子的分子量制備生物素標(biāo)記的小分子物質(zhì)，可以增大生物素標(biāo)記的小分子物質(zhì)與未標(biāo)記的小分子物質(zhì)的分子量差別，從而更容易從反應(yīng)后得到的混合物中除去未標(biāo)記的小分子物質(zhì)，得到更高純度的生物素標(biāo)記的小分子物質(zhì)，但是當(dāng)長鏈分子的分子量大到一定數(shù)值后，再增大長鏈分子的分子量，生物素標(biāo)記的小分子物質(zhì)的純度提高值并不明顯。同理，在一定范圍內(nèi)，生物素標(biāo)記的小分子物質(zhì)的分子量越遠離1000da，使用常規(guī)脫鹽柱進行脫鹽純化時，生物素標(biāo)記的小分子物質(zhì)被截留在脫鹽柱中的量越少，生物素標(biāo)記的小分子物質(zhì)的收率越高，但是當(dāng)生物素標(biāo)記的小分子物質(zhì)的分子量大到一定數(shù)值后，再增大生物素標(biāo)記的小分子物質(zhì)的分子量，生物素標(biāo)記的小分子物質(zhì)的收率提高值并不明顯。而且，當(dāng)生物素標(biāo)記的小分子物質(zhì)的分子量過高時，檢測過程中所形成的免疫復(fù)合物(如：發(fā)光微粒-特異性配對結(jié)合成員-小分子物質(zhì)-長鏈小分子-生物素-親和素-感光微粒)會因鏈條過長使發(fā)光微粒和感光微粒之間的距離過大進而導(dǎo)致二者之間信號傳遞效率降低甚至導(dǎo)致發(fā)光微粒接收不到感光微粒釋放的單線態(tài)氧離子而無法發(fā)光，從而造成檢測時間長或者檢測結(jié)果出現(xiàn)誤差；而將生物素標(biāo)記的小分子物質(zhì)的分子量控制在20000da以內(nèi)，可以保證檢測的效率及檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

35、將本發(fā)明的生物素標(biāo)記的小分子物質(zhì)作為競爭物基于競爭法的原理應(yīng)用于光激化學(xué)發(fā)光免疫檢測中對分子量較小的物質(zhì)進行檢測，具有較高的信號值和區(qū)分度；可以用于檢測分子量較小的物質(zhì)，如激素，解決現(xiàn)有技術(shù)對分子量較小的激素進行檢測時所存在的檢測信號值低和區(qū)分度低的問題，具有良好的應(yīng)用前景。