背景技術(shù)：

1、對(duì)于治療性生物制劑(諸如抗體)的商業(yè)生產(chǎn)，一個(gè)理想的特性是治療劑的表達(dá)產(chǎn)率最大化。表達(dá)產(chǎn)率直接取決于生產(chǎn)滴度以及間接取決于治療相關(guān)的副產(chǎn)物的量。這些副產(chǎn)物可以是例如未正確組裝的治療性多肽、未正確折疊的治療性多肽或降解的治療性多肽。

2、為了重組生產(chǎn)治療性生物制劑，通常使用哺乳動(dòng)物細(xì)胞，諸如cho和hek細(xì)胞。由于它們的起源，這些細(xì)胞也生產(chǎn)蛋白酶，該蛋白酶可以切割治療劑。在治療劑易于被生產(chǎn)細(xì)胞的內(nèi)源性蛋白酶切割的情況下，切割的(即降解的)治療劑作為治療相關(guān)的副產(chǎn)物獲得。

3、在本領(lǐng)域中已經(jīng)以不同的方式解決了這個(gè)問題。

4、wo?99/10503中報(bào)道了一種使用編碼絲氨酸蛋白酶的酶原前體的重組核酸重組生產(chǎn)所述絲氨酸蛋白酶的方法，其中在酶原前體中天然存在的非自催化切割位點(diǎn)被自催化切割位點(diǎn)替換，該自催化切割位點(diǎn)被蛋白酶的活性形式識(shí)別，且由此將酶原前體切割成活性形式。

5、wo?02/61064中報(bào)道了一種使用編碼在前肽序列中具有腸激酶識(shí)別位點(diǎn)的胰蛋白酶原的核酸重組生產(chǎn)胰蛋白酶的方法，該胰蛋白酶原呈可以由宿主細(xì)胞分泌的形式，并且該方法包括培養(yǎng)包含以下的細(xì)胞：在能夠?qū)⒈磉_(dá)產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基中的條件下的所述核酸，由此選擇條件使得至少基本上防止前肽序列的自催化切割。

6、cn111607615中報(bào)道了一種豬流行性腹瀉(pedv)和豬傳染性胃腸炎(tgev)病毒病二聯(lián)亞單位疫苗的制備方法，該方法使用pedv-t2a-tgev-s序列，并且包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)包括所述序列的昆蟲細(xì)胞，該培養(yǎng)基包括將絲氨酸蛋白酶抑制劑抑肽酶、天冬氨酸蛋白酶抑制劑胃酶抑素a、氨肽酶抑制劑貝他汀、半胱氨酸蛋白酶抑制劑e-64和絲氨酸/胱氨酸蛋白酶抑制劑亮肽素的混合物培養(yǎng)24小時(shí)，以獲得含有蛋白酶抑制劑的培養(yǎng)物，并將含有蛋白酶抑制劑的培養(yǎng)物連續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)，以獲得含有表達(dá)的蛋白質(zhì)的培養(yǎng)物。

7、wo?2016/118775中報(bào)道了一種生產(chǎn)穩(wěn)定生產(chǎn)cocal包膜假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的逆轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)細(xì)胞的方法，該方法包括用編碼cocal包膜、自切割肽和選擇標(biāo)志物的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

8、wo?2021/183946中報(bào)道了一種表達(dá)載體，其包括核酸和可選擇標(biāo)志物基因，該核酸包括編碼目的蛋白的開放閱讀框，之后為可在翻譯期間誘導(dǎo)核糖體跳躍的自切割肽。

9、cn110835632中報(bào)道了一種表達(dá)盒，其包括啟動(dòng)子、來源于釀酒酵母的突變型cas9的sgrna框架序列、人尿嘧啶糖苷酶抑制劑、t2a自剪接多肽、綠色熒光蛋白及bgh?polya序列。

10、cn?108441516中報(bào)道了慢病毒cmv-cbh雙啟動(dòng)子修飾的載體plenti-cmv-3flag-egfp-pgk-mcherry-t2a-puro。

11、cn?112626121中報(bào)道了一種三可選擇標(biāo)志物抗體表達(dá)載體，其包括表達(dá)框i和表達(dá)框ii，其中表達(dá)框ii與表達(dá)框i以正向排列方式相鄰，其中在表達(dá)框i中，嘌呤霉素抗性基因通過ires序列偶聯(lián)在抗體輕鏈基因的下游，并且然后通過e2a多肽將小鼠谷氨酰胺合成酶偶聯(lián)在嘌呤霉素抗性基因的下游，其中在表達(dá)框ii中，二氫葉酸還原酶基因dhfr通過ires序列偶聯(lián)在抗體重鏈基因的下游。

12、wo?2019/157099中報(bào)道了一種鼻噴藥物制劑，其包括腎上腺素或其鹽，并且包括一種或多種吸收增強(qiáng)劑，諸如抑肽酶。

13、wo?2019/239405中報(bào)道了一種口服藥物組合物，其包括高達(dá)100千道爾頓的治療性肽或治療性蛋白質(zhì)、二價(jià)陽離子螯合劑和分離的重組表達(dá)的bowman-birk抑制劑(bbi)，其中該重組表達(dá)的bbi在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)。

14、wo?2008/005847中報(bào)道了fviii可以在含有蛋白酶抑制劑(諸如抑肽酶)的培養(yǎng)基中表達(dá)，例如以約0.01至約5％，或約0.5至約1.0％(vol/vol)的量(抑肽酶，15-30胰蛋白酶抑制劑單位(tiu)/ml，sigma)或?qū)?yīng)量的其他蛋白酶抑制劑的活性單位。

15、wo?2008/135501中報(bào)道了通過培養(yǎng)表達(dá)因子viii多肽的哺乳動(dòng)物細(xì)胞來生產(chǎn)因子viii多肽的方法，其中細(xì)胞培養(yǎng)基包括大豆胰蛋白酶抑制劑。

16、wo?2018/22032中報(bào)道了一種重組生產(chǎn)debrilase的方法，該方法包括培養(yǎng)包含一種或多種載體的宿主細(xì)胞，其中該一種或多種載體在debrilase和debrilase的蛋白質(zhì)抑制劑被表達(dá)的條件下以可表達(dá)形式編碼debrilase和debrilase的蛋白質(zhì)抑制劑，其中debrilase的蛋白質(zhì)抑制劑選自由以下項(xiàng)組成的組：抑肽酶、纖維蛋白溶酶鏈菌素(i16.001)、2k型蛋白酶抑制劑(pin2k,i20.001)、大腸桿菌素(i11.001)、胰蛋白酶抑制劑mcti-1(i07.001)、海鞘胰蛋白酶抑制劑(i05.001)、肽酶抑制劑5(κpi-actitoxin-avd3a，i02.026)和組織因子途徑抑制劑2抑制劑單元1(tfpi2,i02.013)。

17、wo?2021/170839中報(bào)道了使用抑肽酶作為載劑在藻類中生產(chǎn)重組蛋白、多肽或肽，其中抑肽酶和所述重組蛋白、多肽或肽融合在一起形成融合蛋白。

18、因此，需要用于重組生產(chǎn)治療性多肽的改進(jìn)方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本文報(bào)道了通過重組哺乳動(dòng)物細(xì)胞來生產(chǎn)異源多肽的方法，其中該異源多肽易于被所述重組哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)的內(nèi)源蛋白酶切割，由此通過蛋白質(zhì)蛋白酶抑制劑的共表達(dá)來減少所述內(nèi)源蛋白酶對(duì)所述異源多肽的切割。

2、因此，本文報(bào)道了包括編碼選擇標(biāo)志物的第一部分和編碼蛋白質(zhì)蛋白酶抑制劑的第二部分的核酸，由此兩個(gè)部分通過內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(ires)或內(nèi)含肽或自切割肽序列連接。本文同樣報(bào)道了根據(jù)本發(fā)明的核酸在異源多肽的重組生產(chǎn)中的用途以及包含根據(jù)本發(fā)明的所述核酸的細(xì)胞。本文進(jìn)一步報(bào)道了根據(jù)本發(fā)明的核酸用于增加重組生產(chǎn)的異源多肽的產(chǎn)率的用途以及其用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的生產(chǎn)期間減少重組異源多肽的蛋白酶切割的用途。

3、本發(fā)明至少部分地基于以下發(fā)現(xiàn)：選擇標(biāo)志物和蛋白質(zhì)蛋白酶抑制劑的組合在單一的、即相同的順反子中，例如使用ires或內(nèi)含肽或自切割肽序列是有利的并且提供改進(jìn)。其中，這些改進(jìn)至少是在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的異源多肽的重組生產(chǎn)(表達(dá))期間減少了蛋白酶切割，并由此增加了生產(chǎn)量(產(chǎn)率)。同時(shí)，與不包括根據(jù)本發(fā)明的核酸的細(xì)胞相比，重組異源多肽的表達(dá)并沒有減少。

4、本發(fā)明至少部分地基于以下發(fā)現(xiàn)：與不表達(dá)蛋白質(zhì)蛋白酶抑制劑的細(xì)胞相比，蛋白質(zhì)蛋白酶抑制劑和重組異源多肽的標(biāo)準(zhǔn)共表達(dá)減少了異源多肽的量(產(chǎn)率)。

5、本發(fā)明至少部分地基于以下發(fā)現(xiàn)：表達(dá)異源多肽的細(xì)胞中單一蛋白酶或單一蛋白酶的所有變體的敲除不會(huì)導(dǎo)致作為根據(jù)本發(fā)明的核酸的用途的重組異源多肽的量(產(chǎn)率)的相同增加。不受此理論的束縛，假設(shè)在異源多肽的重組生產(chǎn)期間觀察到切割的情況下，其通常是由多于一種蛋白酶引起的。

6、本發(fā)明進(jìn)一步至少部分地基于以下發(fā)現(xiàn)：用于驅(qū)動(dòng)根據(jù)本發(fā)明的核酸表達(dá)的啟動(dòng)子不應(yīng)為強(qiáng)啟動(dòng)子，即其不應(yīng)為例如cmv啟動(dòng)子、人ef1a啟動(dòng)子或cag啟動(dòng)子。已發(fā)現(xiàn)使用具有中等強(qiáng)度的啟動(dòng)子(諸如例如sv40啟動(dòng)子、pgk1啟動(dòng)子或ubc啟動(dòng)子)是有利的，其中sv40啟動(dòng)子為一種優(yōu)選的啟動(dòng)子。

7、需要指出的是，在以下方面和實(shí)施例中，術(shù)語“自切割肽序列”可以被術(shù)語“ires”或術(shù)語“內(nèi)含肽”替代，而不脫離本發(fā)明。這些也為本發(fā)明的具體方面和實(shí)施例。

8、當(dāng)ires元件放置在兩個(gè)基因之間時(shí)，其介導(dǎo)第二個(gè)基因的帽獨(dú)立翻譯。

9、內(nèi)含肽通常側(cè)翼為兩個(gè)基因，并在剪接發(fā)生之前一起翻譯成單一多肽，以去除內(nèi)含肽來用新鍵連接側(cè)翼蛋白。內(nèi)含肽序列的突變抑制剪接，同時(shí)保留切割。

10、本發(fā)明的一個(gè)方面為(分離的)核酸，其在5'至3'或3'至5'方向上以可操作連接的形式包括以下元件：

11、a)編碼選擇標(biāo)志物的核酸，

12、b)編碼自切割肽序列的核酸，以及

13、c)編碼蛋白質(zhì)蛋白酶抑制劑的核酸。

14、在所有方面和實(shí)施例的某些實(shí)施例中，核酸進(jìn)一步以可操作連接的形式包括以下元件：

15、d)在a)(5'至3'方向)或c)(3'至5'方向)核酸上游(5')的啟動(dòng)子，

16、e)在c)(5'至3'方向)或a)(3'至5'方向)核酸下游(3')的聚腺苷酸化信號(hào)序列，以及

17、f)任選的在e)的核酸下游(3')的終止子序列。

18、在所有方面和實(shí)施例的某些實(shí)施例中，編碼選擇標(biāo)志物的核酸選自由以下項(xiàng)組成的組：編碼嘌呤霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶的核酸、組氨醇脫氫酶、胸苷激酶、潮霉素b磷酸轉(zhuǎn)移酶、二氫葉酸還原酶、殺稻瘟菌素脫氨酶、谷氨酰胺合成酶、吉?dú)W霉素抗性基因、博萊霉素抗性基因和氨基糖苷3'磷酸轉(zhuǎn)移酶。

19、在所有方面和實(shí)施例的某些實(shí)施例中，編碼選擇標(biāo)志物的核酸編碼能夠使嘌呤霉素失活/對(duì)嘌呤霉素進(jìn)行修飾的嘌呤霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶或其功能變體。

20、在所有方面和實(shí)施例的某些實(shí)施例中，編碼選擇標(biāo)志物的核酸編碼能夠使嘌呤霉素失活/對(duì)嘌呤霉素進(jìn)行修飾的seq?id?no:01(smaa；uniprot?p13249(puac_strad)，不包括n末端甲硫氨酸殘基)的氨基酸序列或其功能變體。

21、在所有方面和實(shí)施例的某些實(shí)施例中，

22、-編碼選擇標(biāo)志物的核酸具有seq?id?no:02(smnn)的核苷酸序列，或者

23、-編碼選擇標(biāo)志物的核酸為編碼具有seq?id?no:01的氨基酸序列的選擇標(biāo)志物的seq?id?no:02的核苷酸序列的變體，或者

24、-編碼選擇標(biāo)志物的核酸編碼能夠使嘌呤霉素失活/對(duì)嘌呤霉素進(jìn)行修飾的seqid?no:01的功能變體。

25、在所有方面和實(shí)施例的某些實(shí)施例中，自切割肽序列為能夠引起核糖體跳躍的病毒2-a自切割肽序列或其功能變體。

26、在所有方面和實(shí)施例的某些實(shí)施例中，自切割肽序列選自由以下項(xiàng)組成的組：p2a、t2a、f2a、e2a、a2a、d2a、i2a、seq?id?no:64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84的自切割肽或其功能變體。

27、在所有方面和實(shí)施例的某些實(shí)施例中，自切割肽序列為能夠引起核糖體跳躍的t2a或其功能變體。

28、在所有方面和實(shí)施例的某些實(shí)施例中，編碼自切割肽序列的核酸編碼能夠引起核糖體跳躍的seq?id?no:14(scaa)的氨基酸序列或其功能變體。

29、在所有方面和實(shí)施例的某些實(shí)施例中，

30、-編碼自切割肽序列的核酸具有seq?id?no:15(scnn)的核苷酸序列，或者

31、-編碼自切割肽序列的核酸為編碼具有seq?id?no:14(scaa)的氨基酸序列的自切割肽序列的seq?id?no:15(scnn)的核苷酸序列的變體，或者

32、-編碼自切割肽序列的該核酸編碼能夠引起核糖體跳躍的seq?id?no:14(scaa)的功能變體。

33、在所有方面和實(shí)施例的某些實(shí)施例中，蛋白質(zhì)蛋白酶抑制劑抑制選自由以下所組成的蛋白酶的組的一種或多種蛋白酶：adams，adamts，例如adam8；adam9；adam10；adam12；adam15；adam17/tace；adamdec1；adamts1；adamts4；adamts5；天冬氨酸蛋白酶，例如bace或腎素；天冬氨酸組織蛋白酶，例如組織蛋白酶d或組織蛋白酶e；胱天蛋白酶，例如胱天蛋白酶1、胱天蛋白酶2、胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶4、胱天蛋白酶5、胱天蛋白酶6、胱天蛋白酶7、胱天蛋白酶8、胱天蛋白酶9、胱天蛋白酶10或胱天蛋白酶14；半胱氨酸組織蛋白酶，例如組織蛋白酶b、組織蛋白酶c、組織蛋白酶k、組織蛋白酶l、組織蛋白酶s、組織蛋白酶v/l2、組織蛋白酶x/z/p；半胱氨酸蛋白酶，例如cruzipain；豆類；otubain-2；klk，例如klk4、klk5、klk6、klk7、klk8、klk10、klk11、klk13或klk14；金屬蛋白酶，例如meprin；腦啡肽酶；psma；bmp-1；mmp，例如mmp1、mmp2、mmp3、mmp7、mmp8、mmp9、mmp10、mmp11、mmp12、mmp13、mmp14、mmp15、mmp16、mmp17、mmp19、mmp20、mmp23、mmp24、mmp26或mmp27，絲氨酸蛋白酶，例如活化蛋白c，組織蛋白酶a，組織蛋白酶g，凝乳酶，凝血因子蛋白酶(例如fviia、fixa、fxa、fxia、fxiia)，彈性蛋白酶，顆粒酶b，胍基苯甲酸酶，htra1，人嗜中性球彈性蛋白酶，乳鐵蛋白，marapsin，ns3/4a，pace4，胞漿素，psa，tpa，凝血酶，中性蛋白酶，upa；ii型跨膜絲氨酸蛋白酶(ttsp)，例如desc1，dpp-4，fap，hepsin，蛋白切割酶2，蛋白切割酶，tmprss2，tmprss3和tmprss4。

34、在所有方面和實(shí)施例的某些實(shí)施例中，編碼蛋白質(zhì)蛋白酶抑制劑的核酸選自由以下項(xiàng)組成的組：bpti、抑肽酶、亮肽素(llr)、胃酶抑素(ivvvstaasta)、spint1、spink1、hai-1、hai-2或其功能變體。

35、在所有方面和實(shí)施例的某些實(shí)施例中，編碼蛋白質(zhì)蛋白酶抑制劑的核酸編碼能夠抑制一種或多種絲氨酸蛋白酶的bpti或其功能變體。

36、在所有方面和實(shí)施例的某些實(shí)施例中，編碼蛋白質(zhì)蛋白酶抑制劑的核酸編碼能夠抑制一種或多種絲氨酸蛋白酶的seq?id?no:86(aprotaa)的氨基酸序列或其功能變體。

37、在所有方面和實(shí)施例的某些實(shí)施例中，

38、-編碼蛋白質(zhì)蛋白酶抑制劑的核酸具有seq?id?no:87(aprotnn)的核苷酸序列，或者

39、-編碼蛋白質(zhì)蛋白酶抑制劑的核酸為編碼具有seq?id?no:86(aprotaa)的氨基酸序列的蛋白質(zhì)蛋白酶抑制劑的seq?id?no:87(aprotnn)的核苷酸序列的變體或者

40、-編碼蛋白質(zhì)蛋白酶抑制劑的核酸編碼能夠抑制一種或多種絲氨酸蛋白酶的seqid?no:86(aprotaa)的功能變體。

41、在所有方面和實(shí)施例的某些實(shí)施例中，啟動(dòng)子為sv40(猿猴病毒40)啟動(dòng)子或其具有相同(相當(dāng))或較低啟動(dòng)子強(qiáng)度的功能變體。

42、在所有方面和實(shí)施例的某些實(shí)施例中，啟動(dòng)子具有seq?id?no:102(promnn)的核苷酸序列或?yàn)榫哂邢嗤蜉^低啟動(dòng)子強(qiáng)度的其功能變體。

43、在所有方面和實(shí)施例的某些實(shí)施例中，聚腺苷酸化信號(hào)序列為bgh(牛生長(zhǎng)激素)聚腺苷酸化信號(hào)序列。

44、在所有方面和實(shí)施例的某些實(shí)施例中，聚腺苷酸化信號(hào)序列具有seq?id?no:100(polyann)的核苷酸序列。

45、在所有方面和實(shí)施例的某些實(shí)施例中，終止子序列是存在的并且為hgt(人生長(zhǎng)激素終止子)序列。

46、在所有方面和實(shí)施例的某些實(shí)施例中，終止子序列是存在的并且具有seq?id?no:101(termnn)的核苷酸序列。

47、本發(fā)明的一個(gè)方面為包含根據(jù)本發(fā)明的核酸的(重組)細(xì)胞。

48、在所有方面和實(shí)施例的某些實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的核酸穩(wěn)定整合到細(xì)胞的基因體中/細(xì)胞的染色體中。

49、在所有方面和實(shí)施例的某些實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的核酸的單拷貝整合到細(xì)胞的基因體中/細(xì)胞的染色體中。

50、在所有方面和實(shí)施例的某些實(shí)施例中，細(xì)胞進(jìn)一步包含編碼(重組)異源多肽的一個(gè)或多個(gè)核酸序列。

51、在所有方面和實(shí)施例的某些實(shí)施例中，編碼(重組)異源多肽的一個(gè)或多個(gè)核酸序列穩(wěn)定整合到細(xì)胞的基因體中/細(xì)胞的染色體中。

52、在所有方面和實(shí)施例的某些實(shí)施例中，編碼(重組)異源多肽的一個(gè)或多個(gè)核酸序列在單個(gè)位點(diǎn)處整合到細(xì)胞的基因體中/細(xì)胞的一條染色體中的單個(gè)位點(diǎn)中。

53、在所有方面和實(shí)施例的某些實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的核酸和編碼(重組)異源多肽的一個(gè)或多個(gè)核酸序列在相同位點(diǎn)處整合到細(xì)胞的基因體中/到細(xì)胞的染色體中。

54、在所有方面和實(shí)施例的某些實(shí)施例中，細(xì)胞進(jìn)一步包含編碼(重組)異源多肽的一個(gè)或多個(gè)核酸序列，該異源多肽包含一個(gè)或多個(gè)蛋白酶可切割的氨基酸序列/蛋白酶識(shí)別序列。

55、在所有方面和實(shí)施例的某些實(shí)施例中，細(xì)胞進(jìn)一步包含編碼(重組)異源多肽的一個(gè)或多個(gè)核酸序列，該異源多肽包含可由絲氨酸蛋白酶/絲氨酸蛋白酶識(shí)別序列可切割的一個(gè)或多個(gè)氨基酸序列。

56、在所有方面和實(shí)施例的某些實(shí)施例中，細(xì)胞進(jìn)一步包含編碼(重組)異源多肽的一個(gè)或多個(gè)核酸序列，該異源多肽包含由選自由以下所組成的組的蛋白酶可切割的一個(gè)或多個(gè)氨基酸序列：adams，adamts，例如adam8；adam9；adam10；adam12；adam15；adam17/tace；adamdec1；adamts1；adamts4；adamts5；天冬氨酸蛋白酶，例如bace或腎素；天冬氨酸組織蛋白酶，例如組織蛋白酶d或組織蛋白酶e；胱天蛋白酶，例如胱天蛋白酶1、胱天蛋白酶2、胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶4、胱天蛋白酶5、胱天蛋白酶6、胱天蛋白酶7、胱天蛋白酶8、胱天蛋白酶9、胱天蛋白酶10或胱天蛋白酶14；半胱氨酸組織蛋白酶，例如組織蛋白酶b、組織蛋白酶c、組織蛋白酶k、組織蛋白酶l、組織蛋白酶s、組織蛋白酶v/l2、組織蛋白酶x/z/p；半胱氨酸蛋白酶，例如cruzipain；豆類；otubain-2；klk，例如klk4、klk5、klk6、klk7、klk8、klk10、klk11、klk13或klk14；金屬蛋白酶，例如meprin；腦啡肽酶；psma；bmp-1；mmp，例如mmp1、mmp2、mmp3、mmp7、mmp8、mmp9、mmp10、mmp11、mmp12、mmp13、mmp14、mmp15、mmp16、mmp17、mmp19、mmp20、mmp23、mmp24、mmp26或mmp27，絲氨酸蛋白酶，例如活化蛋白c，組織蛋白酶a，組織蛋白酶g，凝乳酶，凝血因子蛋白酶(例如fviia、fixa、fxa、fxia、fxiia)，彈性蛋白酶，顆粒酶b，胍基苯甲酸酶，htra1，人嗜中性球彈性蛋白酶，乳鐵蛋白，marapsin，ns3/4a，pace4，胞漿素，psa，tpa，凝血酶，中性蛋白酶，upa；ii型跨膜絲氨酸蛋白酶(ttsp)，例如desc1，dpp-4，fap，hepsin，蛋白切割酶2，蛋白切割酶，tmprss2，tmprss3或tmprss4；及其任何組合。

57、在所有方面和實(shí)施例的某些實(shí)施例中，重組異源多肽為包含一個(gè)或多個(gè)蛋白酶可切割的氨基酸序列/蛋白酶識(shí)別序列的抗體。

58、在所有方面和實(shí)施例的某些實(shí)施例中，細(xì)胞為哺乳動(dòng)物細(xì)胞。

59、在所有方面和實(shí)施例的某些實(shí)施例中，細(xì)胞為cho細(xì)胞或hek細(xì)胞或bhk細(xì)胞。

60、在所有方面和實(shí)施例的某些實(shí)施例中，細(xì)胞為cho-k1細(xì)胞。

61、本發(fā)明的一個(gè)方面為生產(chǎn)(重組)異源多肽的方法，其中該方法包括下列步驟：

62、-在培養(yǎng)基中培養(yǎng)根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞以生產(chǎn)(重組)異源多肽，

63、-從細(xì)胞或培養(yǎng)基回收(重組)異源多肽，以及

64、-任選地，通過一個(gè)或多個(gè)色譜步驟來純化(重組)異源多肽。

65、在所有方面和實(shí)施例的某些實(shí)施例中，培養(yǎng)是在嘌呤霉素、組氨醇、更昔洛韋、潮霉素、蛋氨酸亞砜亞胺、殺稻瘟菌素、氨甲蝶呤、吉?dú)W霉素、博萊霉素或新霉素(g418)的存在下進(jìn)行的(至少持續(xù)一些時(shí)間/天)。

66、在所有方面和實(shí)施例的某些實(shí)施例中，培養(yǎng)是在嘌呤霉素或其功能變體的存在下進(jìn)行的(至少持續(xù)一些時(shí)間/天)。

67、在所有方面和實(shí)施例的某些實(shí)施例中，與其中使用不包括根據(jù)本發(fā)明的核酸的細(xì)胞的方法相比，回收的未切割的(重組)異源多肽的量增加。

68、本發(fā)明的一個(gè)方面為根據(jù)本發(fā)明的核酸用于減少在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的重組生產(chǎn)期間(重組)異源多肽的蛋白酶切割的用途。

69、本發(fā)明的一個(gè)方面為根據(jù)本發(fā)明的核酸用于增加從哺乳動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)回收的完整/未被蛋白酶切割的(重組)異源多肽的量的用途。

70、本發(fā)明至少涵蓋以下獨(dú)立方面和從屬實(shí)施例：

71、1.一種核酸，其以可操作連接的形式包括以下元件：

72、a)編碼選擇標(biāo)志物的核酸，

73、b)編碼自切割肽序列的核酸，以及

74、c)編碼蛋白質(zhì)蛋白酶抑制劑的核酸。

75、2.根據(jù)實(shí)施例1所述的核酸，其中元件在5'至3'方向上具有a)-b)-c)的序列。

76、3.根據(jù)實(shí)施例1所述的核酸，其中元件在5'至3'方向上具有c)-b)-a)的序列。

77、4.根據(jù)實(shí)施例1至3中任一項(xiàng)所述的核酸，其中核酸進(jìn)一步以可操作連接的形式包括以下元件：

78、d)在第一個(gè)元件上游(5')的啟動(dòng)子，

79、e)在最后一個(gè)元件下游(3')的聚腺苷酸化信號(hào)序列，以及

80、f)任選的在e)的核酸下游(3')的終止子序列。

81、5.根據(jù)實(shí)施例1至4中任一項(xiàng)所述的核酸，其中編碼選擇標(biāo)志物的核酸選自由以下項(xiàng)組成的組：編碼嘌呤霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶的核酸、組氨醇脫氫酶、胸苷激酶、潮霉素b磷酸轉(zhuǎn)移酶、二氫葉酸還原酶、殺稻瘟菌素脫氨酶、谷氨酰胺合成酶、吉?dú)W霉素抗性基因、博萊霉素抗性基因和氨基糖苷3'磷酸轉(zhuǎn)移酶。

82、6.根據(jù)實(shí)施例1至5中任一項(xiàng)所述的核酸，其中編碼選擇標(biāo)志物的核酸編碼能夠使嘌呤霉素失活/對(duì)嘌呤霉素進(jìn)行修飾的嘌呤霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶或其功能變體。

83、7.根據(jù)實(shí)施例1至6中任一項(xiàng)所述的核酸，其中編碼選擇標(biāo)志物的核酸編碼能夠使嘌呤霉素失活/對(duì)嘌呤霉素進(jìn)行修飾的seq?id?no:01的氨基酸序列或其功能變體。

84、8.根據(jù)實(shí)施例1至7中任一項(xiàng)所述的核酸，其中

85、-編碼選擇標(biāo)志物的核酸具有seq?id?no:02的核苷酸序列，或者

86、-編碼選擇標(biāo)志物的核酸為編碼具有seq?id?no:01的氨基酸序列的選擇標(biāo)志物的seq?id?no:02的核苷酸序列的變體，或者

87、-編碼選擇標(biāo)志物的核酸編碼能夠使嘌呤霉素失活/對(duì)嘌呤霉素進(jìn)行修飾的seqid?no:01的功能變體。

88、9.根據(jù)實(shí)施例1至8中任一項(xiàng)所述的核酸，其中編碼選擇標(biāo)志物的核酸編碼seq?idno:01的氨基酸序列。

89、10.根據(jù)實(shí)施例1至9中任一項(xiàng)所述的核酸，其中自切割肽序列為能夠引起核糖體跳躍的病毒2-a自切割肽序列或其功能變體。

90、11.根據(jù)實(shí)施例1至10中任一項(xiàng)所述的核酸，其中自切割肽序列選自由以下項(xiàng)組成的組：p2a、t2a、f2a、e2a、a2a、d2a、i2a、seq?id?no:64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84的自切割肽或其功能變體。

91、12.根據(jù)實(shí)施例1至11中任一項(xiàng)所述的核酸，其中自切割肽序列為能夠引起核糖體跳躍的t2a或其功能變體。

92、13.根據(jù)實(shí)施例1至12中任一項(xiàng)所述的核酸，其中自切割肽序列為t2a。

93、14.根據(jù)實(shí)施例1至13中任一項(xiàng)所述的核酸，其中編碼自切割肽序列的核酸編碼能夠引起核糖體跳躍的seq?id?no:14的氨基酸序列或其功能變體。

94、15.根據(jù)實(shí)施例1至14中任一項(xiàng)所述的核酸，其中

95、-編碼自切割肽序列的核酸具有seq?id?no:15的核苷酸序列，或者

96、-編碼自切割肽序列的核酸為編碼具有seq?id?no:14的氨基酸序列的自切割肽序列的seq?id?no:15的核苷酸序列的變體，或者

97、-編碼自切割肽序列的核酸編碼能夠引起核糖體跳躍的seq?id?no:14的功能變體。

98、16.根據(jù)實(shí)施例1至15中任一項(xiàng)所述的核酸，其中編碼自切割肽序列的核酸編碼seq?id?no:14的氨基酸序列。

99、17.根據(jù)實(shí)施例1至16中任一項(xiàng)所述的核酸，其中蛋白質(zhì)蛋白酶抑制劑抑制選自由以下所組成的蛋白酶的組的一種或多種蛋白酶：adams，adamts，例如adam8；adam9；adam10；adam12；adam15；adam17/tace；adamdec1；adamts1；adamts4；adamts5；天冬氨酸蛋白酶，例如bace或腎素；天冬氨酸組織蛋白酶，例如組織蛋白酶d或組織蛋白酶e；胱天蛋白酶，例如胱天蛋白酶1、胱天蛋白酶2、胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶4、胱天蛋白酶5、胱天蛋白酶6、胱天蛋白酶7、胱天蛋白酶8、胱天蛋白酶9、胱天蛋白酶10或胱天蛋白酶14；半胱氨酸組織蛋白酶，例如組織蛋白酶b、組織蛋白酶c、組織蛋白酶k、組織蛋白酶l、組織蛋白酶s、組織蛋白酶v/l2、組織蛋白酶x/z/p；半胱氨酸蛋白酶，例如cruzipain；豆類；otubain-2；klk，例如klk4、klk5、klk6、klk7、klk8、klk10、klk11、klk13或klk14；金屬蛋白酶，例如meprin；腦啡肽酶；psma；bmp-1；mmp，例如mmp1、mmp2、mmp3、mmp7、mmp8、mmp9、mmp10、mmp11、mmp12、mmp13、mmp14、mmp15、mmp16、mmp17、mmp19、mmp20、mmp23、mmp24、mmp26或mmp27，絲氨酸蛋白酶，例如活化蛋白c，組織蛋白酶a，組織蛋白酶g，凝乳酶，凝血因子蛋白酶(例如fviia、fixa、fxa、fxia、fxiia)，彈性蛋白酶，顆粒酶b，胍基苯甲酸酶，htra1，人嗜中性球彈性蛋白酶，乳鐵蛋白，marapsin，ns3/4a，pace4，胞漿素，psa，tpa，凝血酶，中性蛋白酶，upa；ii型跨膜絲氨酸蛋白酶(ttsp)，例如desc1，dpp-4，fap，hepsin，蛋白切割酶2，蛋白切割酶，tmprss2，tmprss3和tmprss4。

100、18.根據(jù)實(shí)施例1至17中任一項(xiàng)所述的核酸，其中編碼蛋白質(zhì)蛋白酶抑制劑的核酸選自由以下項(xiàng)組成的組：bpti、抑肽酶、亮肽素(llr)、胃酶抑素(ivvvstaasta)、spint1、spink1、hai-1、hai-2或其功能變體。

101、19.根據(jù)實(shí)施例1至18中任一項(xiàng)所述的核酸，其中編碼蛋白質(zhì)蛋白酶抑制劑的核酸編碼能夠抑制一種或多種絲氨酸蛋白酶的bpti或其功能變體。

102、20.根據(jù)實(shí)施例1至19中任一項(xiàng)所述的核酸，其中編碼蛋白質(zhì)蛋白酶抑制劑的核酸編碼bpti。

103、21.根據(jù)實(shí)施例1至20中任一項(xiàng)所述的核酸，其中編碼蛋白質(zhì)蛋白酶抑制劑的核酸編碼能夠抑制一種或多種絲氨酸蛋白酶的seq?id?no:86或者seq?id?no:177的氨基酸序列或其功能變體。

104、22.根據(jù)實(shí)施例1至21中任一項(xiàng)所述的核酸，其中

105、-編碼蛋白質(zhì)蛋白酶抑制劑的核酸具有seq?id?no:87或者seq?id?no:178的核苷酸序列，或者

106、-編碼蛋白質(zhì)蛋白酶抑制劑的核酸為編碼具有seq?id?no:86的氨基酸序列的蛋白質(zhì)蛋白酶抑制劑的seq?id?no:87的核苷酸序列的變體，或者

107、-編碼蛋白質(zhì)蛋白酶抑制劑的核酸編碼能夠抑制一種或多種絲氨酸蛋白酶的seqid?no:86的功能變體。

108、23.根據(jù)實(shí)施例1至22中任一項(xiàng)所述的核酸，其中編碼蛋白質(zhì)蛋白酶抑制劑的核酸編碼能夠抑制一種或多種絲氨酸蛋白酶的seq?id?no:86的氨基酸序列。

109、24.根據(jù)實(shí)施例4至23中任一項(xiàng)所述的核酸，其中啟動(dòng)子為sv40啟動(dòng)子或其具有相同或較低啟動(dòng)子強(qiáng)度的功能變體。

110、25.根據(jù)實(shí)施例4至24中任一項(xiàng)所述的核酸，其中啟動(dòng)子為sv40啟動(dòng)子。

111、26.根據(jù)實(shí)施例4至25中任一項(xiàng)所述的核酸，其中啟動(dòng)子具有seq?id?no:102的核苷酸序列。

112、27.根據(jù)實(shí)施例4至26中任一項(xiàng)所述的核酸，其中聚腺苷酸化信號(hào)序列為bgh聚腺苷酸化信號(hào)序列。

113、28.根據(jù)實(shí)施例4至27中任一項(xiàng)所述的核酸，其中聚腺苷酸化信號(hào)序列具有seq?idno:100的核苷酸序列。

114、29.根據(jù)實(shí)施例4至28中任一項(xiàng)所述的核酸，其中終止子序列是存在的且為hgt終止子序列。

115、30.根據(jù)實(shí)施例4至29中任一項(xiàng)所述的核酸，其中終止子序列是存在的且具有seqid?no:101的核苷酸序列。

116、31.一種載體，其包括根據(jù)實(shí)施例1至30中任一項(xiàng)所述的核酸和任選的另外的調(diào)節(jié)元件。

117、32.一種細(xì)胞，其包含根據(jù)實(shí)施例1至30中任一項(xiàng)所述的核酸或根據(jù)實(shí)施例31的載體。

118、33.根據(jù)實(shí)施例32所述的細(xì)胞，其中核酸穩(wěn)定整合到細(xì)胞的基因體中/細(xì)胞的染色體中。

119、34.根據(jù)實(shí)施例32至33中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞，其中核酸的單拷貝整合到細(xì)胞的基因體中/細(xì)胞的染色體中。

120、35.根據(jù)實(shí)施例32至34中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞，其中細(xì)胞進(jìn)一步包含編碼異源多肽的一個(gè)或多個(gè)核酸序列。

121、36.根據(jù)實(shí)施例35所述的細(xì)胞，其中編碼異源多肽的一個(gè)或多個(gè)核酸序列穩(wěn)定整合到細(xì)胞的基因體中/細(xì)胞的染色體中。

122、37.根據(jù)實(shí)施例35至36中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞，其中編碼異源多肽的一個(gè)或多個(gè)核酸序列在單個(gè)位點(diǎn)處整合到細(xì)胞的基因體中/細(xì)胞的一條染色體中的單個(gè)位點(diǎn)中。

123、38.根據(jù)實(shí)施例35至37中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞，其中根據(jù)實(shí)施例1至30中任一項(xiàng)所述的核酸或根據(jù)實(shí)施例31所述的質(zhì)粒以及編碼異源多肽的一個(gè)或多個(gè)核酸序列在相同位點(diǎn)處整合到細(xì)胞的基因體中/到細(xì)胞的染色體中。

124、39.根據(jù)實(shí)施例35至38中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞，其中異源多肽包含一個(gè)或多個(gè)蛋白酶可切割的氨基酸序列/蛋白酶識(shí)別序列。

125、40.根據(jù)實(shí)施例35至39中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞，其中異源多肽包含可由絲氨酸蛋白酶/絲氨酸蛋白酶識(shí)別序列可切割的一個(gè)或多個(gè)氨基酸序列。

126、41.根據(jù)實(shí)施例32至40中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞，其中細(xì)胞進(jìn)一步包含編碼重組異源多肽的一個(gè)或多個(gè)核酸序列，該異源多肽包含由選自由以下所組成的組的蛋白酶可切割的一個(gè)或多個(gè)氨基酸序列：adams，adamts，例如adam8；adam9；adam10；adam12；adam15；adam17/tace；adamdec1；adamts1；adamts4；adamts5；天冬氨酸蛋白酶，例如bace或腎素；天冬氨酸組織蛋白酶，例如組織蛋白酶d或組織蛋白酶e；胱天蛋白酶，例如胱天蛋白酶1、胱天蛋白酶2、胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶4、胱天蛋白酶5、胱天蛋白酶6、胱天蛋白酶7、胱天蛋白酶8、胱天蛋白酶9、胱天蛋白酶10或胱天蛋白酶14；半胱氨酸組織蛋白酶，例如組織蛋白酶b、組織蛋白酶c、組織蛋白酶k、組織蛋白酶l、組織蛋白酶s、組織蛋白酶v/l2、組織蛋白酶x/z/p；半胱氨酸蛋白酶，例如cruzipain；豆類；otubain-2；klk，例如klk4、klk5、klk6、klk7、klk8、klk10、klk11、klk13或klk14；金屬蛋白酶，例如meprin；腦啡肽酶；psma；bmp-1；mmp，例如mmp1、mmp2、mmp3、mmp7、mmp8、mmp9、mmp10、mmp11、mmp12、mmp13、mmp14、mmp15、mmp16、mmp17、mmp19、mmp20、mmp23、mmp24、mmp26或mmp27，絲氨酸蛋白酶，例如活化蛋白c，組織蛋白酶a，組織蛋白酶g，凝乳酶，凝血因子蛋白酶(例如fviia、fixa、fxa、fxia、fxiia)，彈性蛋白酶，顆粒酶b，胍基苯甲酸酶，htra1，人嗜中性球彈性蛋白酶，乳鐵蛋白，marapsin，ns3/4a，pace4，胞漿素，psa，tpa，凝血酶，中性蛋白酶，upa；ii型跨膜絲氨酸蛋白酶(ttsp)，例如desc1，dpp-4，fap，hepsin，蛋白切割酶2，蛋白切割酶，tmprss2，tmprss3或tmprss4；及其任何組合。

127、42.根據(jù)實(shí)施例35至41中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞，其中異源多肽為包含一個(gè)或多個(gè)蛋白酶可切割的氨基酸序列的抗體。

128、43.根據(jù)實(shí)施例32至42中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞，其中細(xì)胞為哺乳動(dòng)物細(xì)胞。

129、44.根據(jù)實(shí)施例32至43中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞，其中細(xì)胞為cho細(xì)胞或hek細(xì)胞或bhk細(xì)胞。

130、45.根據(jù)實(shí)施例32至44中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞，其中細(xì)胞為cho-k1細(xì)胞。

131、46.一種用于在重組細(xì)胞中生產(chǎn)異源多肽的方法，其中該方法包括以下步驟：

132、-在培養(yǎng)基中培養(yǎng)根據(jù)實(shí)施例35至45中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞以生產(chǎn)異源多肽，

133、-從細(xì)胞或培養(yǎng)基回收異源多肽，以及

134、-任選地，通過一個(gè)或多個(gè)色譜步驟純化異源多肽。

135、47.根據(jù)實(shí)施例46所述的方法，其中培養(yǎng)是在嘌呤霉素、組氨醇、更昔洛韋、潮霉素、蛋氨酸亞砜亞胺、殺稻瘟菌素、氨甲蝶呤、吉?dú)W霉素、博萊霉素或新霉素(g418)的存在下進(jìn)行的。

136、48.根據(jù)實(shí)施例46至47中任一項(xiàng)所述的方法酸，其中培養(yǎng)是在嘌呤霉素或其功能變體的存在下進(jìn)行的。

137、49.根據(jù)實(shí)施例46至48中任一項(xiàng)所述的方法酸，其中培養(yǎng)是在嘌呤霉素的存在下進(jìn)行的。

138、50.根據(jù)實(shí)施例46至49中任一項(xiàng)所述的方法，其中，與其中使用不包含根據(jù)實(shí)施例1至30中任一項(xiàng)所述的核酸或根據(jù)實(shí)施例31所述的載體的細(xì)胞的方法相比，回收的未切割的異源多肽的量增加。

139、51.根據(jù)實(shí)施例1至30中任一項(xiàng)所述的核酸或根據(jù)實(shí)施例31所述的載體用于減少在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的重組生產(chǎn)期間異源多肽的蛋白酶切割的用途。

140、52.根據(jù)實(shí)施例1至30中任一項(xiàng)所述的核酸或根據(jù)實(shí)施例31所述的載體用于增加從培養(yǎng)重組所述異源多肽的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中回收的完整/未被蛋白酶切割的異源多肽的量的用途。

141、除本文所描繪和要求保護(hù)的各種方面和實(shí)施例之外，本文所公開的主題還涉及具有本文所公開和要求保護(hù)的特征的其他組合的其他方面和實(shí)施例。因此，本文所呈現(xiàn)的特定特征，尤其是作為方面或?qū)嵤├尸F(xiàn)的，可在本文所公開的主題范圍內(nèi)以其他方式彼此組合，使得本文所公開的主題包括本文所公開的特征的任何合適的組合。出于圖示和描述的目的，已經(jīng)呈現(xiàn)了所公開主題的具體實(shí)施例的描述。其并不旨在窮舉或?qū)⒈疚乃_的主題限制為所公開的那些實(shí)施例。