本發(fā)明涉及生物，具體地，本發(fā)明涉及pdl1的抗體及其應(yīng)用，更具體地，本發(fā)明涉及能夠特異性結(jié)合pdl1的抗體或其抗原結(jié)合片段、核酸分子、表達(dá)載體、重組細(xì)胞、藥物組合物、制藥用途、試劑盒以及小鼠b細(xì)胞。

背景技術(shù)：

1、程序性死亡因子1配體1(programmed?death?1ligand?1,pdl1或pd-l1)又稱cd274或b7h1，為b7家族成員，是一種i型跨膜糖蛋白，胞外區(qū)有igv和igc結(jié)構(gòu)域，胞內(nèi)區(qū)有30個氨基酸殘基，表達(dá)于b細(xì)胞、t細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞、肥大細(xì)胞等免疫細(xì)胞上，也在胰島細(xì)胞、肝kupffer細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和一些上皮細(xì)胞等非免疫細(xì)胞上表達(dá)，并且在多種惡性實體腫瘤和血液腫瘤的癌細(xì)胞或腫瘤微環(huán)境免疫細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)。pdl1在腫瘤細(xì)胞中的高表達(dá)與癌癥患者的不良預(yù)后相關(guān)。與其他b7家族成員不同的是，pdl1具有負(fù)向調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的作用。pdl1是pd1的配體。

2、程序性死亡因子1(programmed?death?1,pd1或pd-1)又稱cd279，為cd28家族成員，是免疫球蛋白超家族i型跨膜糖蛋白，全長288個氨基酸殘基，n端是單一的igv樣結(jié)構(gòu)域，約20個氨基酸殘基的莖結(jié)構(gòu)將igv結(jié)構(gòu)與細(xì)胞膜隔開，c端是跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)。pd1表達(dá)于b細(xì)胞、樹突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和活化的t淋巴細(xì)胞表面。

3、正常情況下pdl1與pd1相互作用，或激活pd1信號通路，pd1能夠抑制t淋巴細(xì)胞的功能，促進(jìn)treg細(xì)胞功能，從而抑制自身免疫應(yīng)答，防止自身免疫性疾病的發(fā)生。但在腫瘤的發(fā)生中，pd1與腫瘤細(xì)胞表達(dá)的pdl1結(jié)合，傳導(dǎo)免疫抑制信號，抑制t細(xì)胞的增殖和活性，促進(jìn)腫瘤的免疫逃逸。

4、抗pdl1抗體可阻斷pdl1結(jié)合pd1，抑制pdl1/pd1信號傳導(dǎo)，可活化免疫應(yīng)答，這些免疫應(yīng)答不僅可以對抗癌細(xì)胞生長，而且對抗人體內(nèi)的病毒感染及擴增。

5、因此，盡管pdl1抗體腫瘤免疫療法在近些年取得一定的成績，由于不同pdl1抗體氨基酸序列，尤其是cdr區(qū)序列存在異質(zhì)性，因而它們的特點及治療腫瘤的效果也不盡相同，仍然需要科研工作者不斷的開發(fā)和改進(jìn)，給癌癥、感染等疾病患者提供更多的用藥選擇。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、在本發(fā)明的的第一方面，本發(fā)明提出了一種分離的抗體或其抗原結(jié)合片段。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述抗體或其抗原結(jié)合片段含有選自下列至少之一的cdr序列或與其具有至少95％同一性的氨基酸序列：

2、重鏈可變區(qū)cdr序列：seq?id?no:1～13；輕鏈可變區(qū)cdr序列：seq?in?no:14～27。

3、eytlh(seq?id?no:1)。

4、gihpnygdstytqkfkg(seq?id?no:2)。

5、ghgfahyvmdy(seq?id?no:3)。

6、sgywn(seq?id?no:4)。

7、yisytgstyynpslks(seq?id?no:5)。

8、sanwgrgawfay(seq?id?no:6)。

9、ggddwllpwftf(seq?id?no:7)。

10、syvms(seq?id?no:8)。

11、tissggsytyysdsvkg(seq?id?no:9)。

12、ygsshyyfdn(seq?id?no:10)。

13、gytms(seq?id?no:11)。

14、tissggsytyypdsvkg(seq?id?no:12)。

15、dgdtsfyfdy(seq?id?no:13)。

16、rasqslshylh(seq?id?no:14)。

17、yasqsis(seq?id?no:15)。

18、qnghsfppt(seq?id?no:16)。

19、rasksiskyla(seq?id?no:17)。

20、sgstlqs(seq?id?no:18)。

21、qhhneypyt(seq?id?no:19)。

22、rasksiskylv(seq?id?no:20)。

23、qqyneypwt(seq?id?no:21)。

24、sasssvsymy(seq?id?no:22)。

25、dttnlas(seq?id?no:23)。

26、qqwsshplt(seq?id?no:24)。

27、sasssvsyvy(seq?id?no:25)。

28、dtsnlas(seq?id?no:26)。

29、qqwssyplt(seq?id?no:27)。

30、根據(jù)本發(fā)明實施例的上述抗體或其抗原結(jié)合片段能夠特異性的靶向結(jié)合pdl1，阻斷pd1和pdl1的結(jié)合。

31、根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述抗體或其抗原結(jié)合片段包含：

32、當(dāng)由kabat編號系統(tǒng)定義時，

33、分別如seq?id?no:1、2和3或者與seq?id?no:1、2和3具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的重鏈可變區(qū)cdr1、cdr2、cdr3序列；或者

34、分別如seq?id?no:4、5和6或者與seq?id?no:4、5和6具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的重鏈可變區(qū)cdr1、cdr2、cdr3序列；或者

35、分別如seq?id?no:4、5和7或者與seq?id?no:4、5和7具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的重鏈可變區(qū)cdr1、cdr2、cdr3序列；或者

36、分別如seq?id?no:8、9和10或者與seq?id?no:8、9和10具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的重鏈可變區(qū)cdr1、cdr2、cdr3序列；或者

37、分別如seq?id?no:11、12和13或者與seq?id?no:11、12和13具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的重鏈可變區(qū)cdr1、cdr2、cdr3序列。

38、根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述抗體或其抗原結(jié)合片段包含：

39、當(dāng)由kabat編號系統(tǒng)定義時，

40、分別如seq?id?no:14、15和16或者與seq?id?no:14、15和16具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的輕鏈可變區(qū)cdr1、cdr2、cdr3序列；或者

41、分別如seq?id?no:17、18和19或者與seq?id?no:17、18和19具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的輕鏈可變區(qū)cdr1、cdr2、cdr3序列；或者

42、分別如seq?id?no:20、18和21或者與seq?id?no:20、18和21具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的輕鏈可變區(qū)cdr1、cdr2、cdr3序列；或者

43、分別如seq?id?no:22、23和24或者與seq?id?no:22、23和24具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的輕鏈可變區(qū)cdr1、cdr2、cdr3序列；或者

44、分別如seq?id?no:25、26和27或者與seq?id?no:25、26和27具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的輕鏈可變區(qū)cdr1、cdr2、cdr3序列。

45、根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述抗體或其抗原結(jié)合片段特異性結(jié)合pdl1或pdl1-fc融合蛋白。

46、在一些實施方案中，所述抗體或其抗原結(jié)合片段特異性結(jié)合人源pdl1或其pdl1-fc融合蛋白；在一些實施方案中，所述抗體或其抗原結(jié)合片段特異性結(jié)合猴源pdl1或其pdl1-fc融合蛋白。

47、根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述抗體或其抗原結(jié)合片段含有重鏈框架區(qū)序列和輕鏈框架區(qū)序列的至少之一，所述重鏈框架區(qū)序列和輕鏈框架區(qū)序列的至少之一的至少一部分來自于嚙齒動物、人、雞、駱駝、鴕鳥、綿羊、牛、非人靈長類動物或鯊魚。

48、根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述抗體或其抗原結(jié)合片段含有重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含如seq?id?no：28～32任一項所示氨基酸序列或者與seq?id?no:28～32任一項具有至少95％同一性的氨基酸序列。

49、根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述抗體或其抗原結(jié)合片段含有輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)包含如seq?id?no：33～37任一項所示氨基酸序列或者與seq?id?no:33～37任一項具有至少95％同一性的氨基酸序列。

50、evqlqqsgpelvkpgasvkvscktsgysfteytlhwvkqshgkslewiggihpnyg?dstytqkfkgkatltvdkssstaymelrsltsedsavyycarghgfahyvmdywgqgt?svtvss(seq?id?no:28)。

51、evqlqesgpslvkpsqtlsltcsvtgdsitsgywnwirkfpgnkleymgyisytgst?yynpslksrisvtrdtsknqyylqlnsvttedtatyycarsanwgrgawfaywgqgtl?vtvsa(seq?id?no:29)。

52、evqlqesgpslvkpsqtlsltcsvtgdsitsgywnwirkfpgnkleymgyisytgst?yynpslksrisitrdtsknqyflqlnsvttedtstyycarggddwllpwftfwgqgtlv?tvsa(seq?id?no:30)。

53、evqlvesggglvkpggslklscaasgitfssyvmswvrqtpekrlewvatissggsy?tyysdsvkgrftisrdnakntlflqmtslrsedtamyycakygsshyyfdnwgqgttl?tvss(seq?id?no:31)。

54、dvklvesggglvkpggslklscaasgftfsgytmswvrqtpekrlewvatissggs?ytyypdsvkgrftisrdsakntlylqmsslksedtamyyctrdgdtsfyfdywgqgitl?tvss(seq?id?no:32)。

55、divmtqspatlsvipgdrvslscrasqslshylhwyqkksresprllikyasqsisgip?srfsgrgsgsdftltinsvepedvgvyycqnghsfpptfgagtklel(seq?id?no:33)。

56、dvqmiqtpsylaaspgetitincrasksiskylawyqekpgktnklliysgstlqsgip?srfsgsgsgtdftltisslepedfamyycqhhneypytfgggtklei(seq?id?no:34)。

57、diqitqspsylaaspgetitincrasksiskylvwyqekpgktnkvliysgstlqsgips?rfsgsgsgtdftltisslepedfamyycqqyneypwtfgggtklks(seq?id?no:35)。

58、qivltqspaimsaspgekvtmtcsasssvsymywyqqkpgysprlliydttnlasgv?pvrfsasgsgtsysltisrmeaedaatyycqqwsshpltfgagtklel(seq?id?no:36)。

59、qivltqspaimsaspgekvtmtcsasssvsyvywyqqkpgssprlliydtsnlasgvp?vrfsgsgsgtsysltisrmeaedaatyycqqwssypltfgagtklei(seq?id?no:37)。

60、根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述抗體含有重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)的至少之一，所述重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)的至少之一的至少一部分來自嚙齒動物、人、雞、駱駝、鴕鳥、綿羊、牛、非人靈長類動物或鯊魚。

61、根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述抗體的重鏈恒定區(qū)為igg1亞型、igg2亞型、igg3亞型或igg4亞型。

62、根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述抗體的輕鏈恒定區(qū)為κ亞型或λ亞型。

63、在一些實施方案中，所述抗體的重鏈恒定區(qū)為igg2亞型，輕鏈恒定區(qū)為κ亞型。

64、根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述抗體的輕鏈恒定區(qū)和重鏈恒定區(qū)均來自于鼠源抗體或其突變體。

65、根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述抗體的輕鏈恒定區(qū)和重鏈恒定區(qū)均來自于鼠源igg2。

66、根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述抗體恒定區(qū)的全長序列如seq?id?no:48或49所示。

67、akttapsvyplapvcgdttgssvtlgclvkgyfpepvtltwnsgslssgvhtfpavlqsdlytlsssvtvtsstwpsqsitcnvahpasstkvdkkieprgptikpcppckcpapnllggpsvfifppkikdvlmislspivtcvvvdvseddpdvqiswfvnnvevhtaqtqthredynstlrvvsalpiqhqdwmsgkefkckvnnkdlpapiertiskpkgsvrapqvyvlpppeeemtkkqvtltcmvtdfmpediyvewtnngktelnykntepvldsdgsyfmysklrvekknwvernsyscsvvheglhnhhttksfsrtpgk(seq?id?no:48)。

68、kradaaptvsifppsseqltsggasvvcflnnfypkdinvkwkidgserqngvlnsw?tdqdskdstysmsstltltkdeyerhnsytceathktstspivksfnrnec(seq?id?no:49)。

69、其中，上述seq?id?no:48所示的抗體恒定區(qū)的全長序列包括igg2重鏈ch1區(qū)、鉸鏈區(qū)和fc區(qū)，其中，igg2重鏈ch1區(qū)序列為akttapsvyplapvcgdttgssvtlgclvkgyfpepvtltwnsgslssgvhtfpavlqsdl?ytlsssvtvtsstwpsqsitcnvahpasstkvdkki，鉸鏈區(qū)序列為eprgptikpcp，fc區(qū)序列為pckcpapnllggpsvfifppkikdvlmislspivtcvvvdvseddpdvqiswfvnnvevhtaqtqthredynstlrvvsalpiqhqdwmsgkefkckvnnkdlpapiertiskpkgsvrapqvyvlpppeeemtkkqvtltcmvtdfmpediyvewtnngktelnykntepvldsdgsyfmysklrvekknwvernsyscsvvheglhnhhttksfsrtpgk。

70、上述seq?id?no:49所示的抗體恒定區(qū)的全長序列為kappa輕鏈恒定區(qū)。

71、根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述抗體具有seq?id?no:38～42任一項所示氨基酸序列的重鏈和或seq?id?no:43～47任一項所示氨基酸序列的輕鏈。

72、evqlqqsgpelvkpgasvkvscktsgysfteytlhwvkqshgkslewiggihpnygdstytqkfkgkatltvdkssstaymelrsltsedsavyycarghgfahyvmdywgqgtsvtvssakttapsvyplapvcgdttgssvtlgclvkgyfpepvtltwnsgslssgvhtfpavlqsdlytlsssvtvtsstwpsqsitcnvahpasstkvdkkieprgptikpcppckcpapnllggpsvfifppkikdvlmislspivtcvvvdvseddpdvqiswfvnnvevhtaqtqthredynstlrvvsalpiqhqdwmsgkefkckvnnkdlpapiertiskpkgsvrapqvyvlpppeeemtkkqvtltcmvtdfmpediyvewtnngktelnykntepvldsdgsyfmysklrvekknwvernsyscsvvheglhnhhttksfsrtpgk(seq?id?no:38)。

73、evqlqesgpslvkpsqtlsltcsvtgdsitsgywnwirkfpgnkleymgyisytgstyynpslksrisvtrdtsknqyylqlnsvttedtatyycarsanwgrgawfaywgqgtlvtvsaakttapsvyplapvcgdttgssvtlgclvkgyfpepvtltwnsgslssgvhtfpavlqsdlytlsssvtvtsstwpsqsitcnvahpasstkvdkkieprgptikpcppckcpapnllggpsvfifppkikdvlmislspivtcvvvdvseddpdvqiswfvnnvevhtaqtqthredynstlrvvsalpiqhqdwmsgkefkckvnnkdlpapiertiskpkgsvrapqvyvlpppeeemtkkqvtltcmvtdfmpediyvewtnngktelnykntepvldsdgsyfmysklrvekknwvernsyscsvvheglhnhhttksfsrtpgk(seq?id?no:39)。

74、evqlqesgpslvkpsqtlsltcsvtgdsitsgywnwirkfpgnkleymgyisytgstyynpslksrisitrdtsknqyflqlnsvttedtstyycarggddwllpwftfwgqgtlvtvsaakttapsvyplapvcgdttgssvtlgclvkgyfpepvtltwnsgslssgvhtfpavlqsdlytlsssvtvtsstwpsqsitcnvahpasstkvdkkieprgptikpcppckcpapnllggpsvfifppkikdvlmislspivtcvvvdvseddpdvqiswfvnnvevhtaqtqthredynstlrvvsalpiqhqdwmsgkefkckvnnkdlpapiertiskpkgsvrapqvyvlpppeeemtkkqvtltcmvtdfmpediyvewtnngktelnykntepvldsdgsyfmysklrvekknwvernsyscsvvheglhnhhttksfsrtpgk(seq?id?no:40)。

75、evqlvesggglvkpggslklscaasgitfssyvmswvrqtpekrlewvatissggsytyysdsvkgrftisrdnakntlflqmtslrsedtamyycakygsshyyfdnwgqgttltvssakttapsvyplapvcgdttgssvtlgclvkgyfpepvtltwnsgslssgvhtfpavlqsdlytlsssvtvtsstwpsqsitcnvahpasstkvdkkieprgptikpcppckcpapnllggpsvfifppkikdvlmislspivtcvvvdvseddpdvqiswfvnnvevhtaqtqthredynstlrvvsalpiqhqdwmsgkefkckvnnkdlpapiertiskpkgsvrapqvyvlpppeeemtkkqvtltcmvtdfmpediyvewtnngktelnykntepvldsdgsyfmysklrvekknwvernsyscsvvheglhnhhttksfsrtpgk(seq?id?no:41)。

76、dvklvesggglvkpggslklscaasgftfsgytmswvrqtpekrlewvatissggsytyypdsvkgrftisrdsakntlylqmsslksedtamyyctrdgdtsfyfdywgqgitltvssakttapsvyplapvcgdttgssvtlgclvkgyfpepvtltwnsgslssgvhtfpavlqsdlytlsssvtvtsstwpsqsitcnvahpasstkvdkkieprgptikpcppckcpapnllggpsvfifppkikdvlmislspivtcvvvdvseddpdvqiswfvnnvevhtaqtqthredynstlrvvsalpiqhqdwmsgkefkckvnnkdlpapiertiskpkgsvrapqvyvlpppeeemtkkqvtltcmvtdfmpediyvewtnngktelnykntepvldsdgsyfmysklrvekknwvernsyscsvvheglhnhhttksfsrtpgk(seq?id?no:42)。

77、divmtqspatlsvipgdrvslscrasqslshylhwyqkksresprllikyasqsisgipsrfsgrgsgsdftltinsvepedvgvyycqnghsfpptfgagtklelkradaaptvsifppsseqltsggasvvcflnnfypkdinvkwkidgserqngvlnswtdqdskdstysmsstltltkdeyerhnsytceathktstspivksfnrnec(seq?idno:43)。

78、dvqmiqtpsylaaspgetitincrasksiskylawyqekpgktnklliysgstlqsgipsrfsgsgsgtdftltisslepedfamyycqhhneypytfgggtkleikradaaptvsifppsseqltsggasvvcflnnfypkdinvkwkidgserqngvlnswtdqdskdstysmsstltltkdeyerhnsytceathktstspivksfnrnec(seq?idno:44)。

79、diqitqspsylaaspgetitincrasksiskylvwyqekpgktnkvliysgstlqsgipsrfsgsgsgtdftltisslepedfamyycqqyneypwtfgggtklkskradaaptvsifppsseqltsggasvvcflnnfypkdinvkwkidgserqngvlnswtdqdskdstysmsstltltkdeyerhnsytceathktstspivksfnrnec(seq?idno:45)。

80、qivltqspaimsaspgekvtmtcsasssvsymywyqqkpgysprlliydttnlasgvpvrfsasgsgtsysltisrmeaedaatyycqqwsshpltfgagtklelkradaaptvsifppsseqltsggasvvcflnnfypkdinvkwkidgserqngvlnswtdqdskdstysmsstltltkdeyerhnsytceathktstspivksfnrnec(seq?idno:46)。

81、qivltqspaimsaspgekvtmtcsasssvsyvywyqqkpgssprlliydtsnlasgvpvrfsgsgsgtsysltisrmeaedaatyycqqwssypltfgagtkleikradaaptvsifppsseqltsggasvvcflnnfypkdinvkwkidgserqngvlnswtdqdskdstysmsstltltkdeyerhnsytceathktstspivksfnrnec(seq?idno:47)。

82、根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述抗體為單克隆抗體。

83、根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述抗體或其抗原結(jié)合片段為全抗體、單鏈抗體、多聚體抗體、cdr移植抗體、融合蛋白、多價抗體、fab片段、fv片段、單域抗體或最小識別單位的至少之一。

84、其中，在本技術(shù)中，上述單鏈抗體包括seq?id?no:28～32任一項所示氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和seq?id?no:33～37任一項所示氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)，其中所述重鏈可變區(qū)的c端通過連接肽linker與所述輕鏈可變區(qū)的n端相連，可表示為vh-link-vl(vl表示輕鏈可變區(qū)，vh表示重鏈可變區(qū)，link表示連接vl和vh的連接鏈)，或所述輕鏈可變區(qū)的c端通過連接肽linker與所述重鏈可變區(qū)的n端相連,可表示為vl-link-vh(vl表示輕鏈可變區(qū)，vh表示重鏈可變區(qū)，link表示連接vl和vh的連接鏈)。

85、根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述多價抗體為同源同價抗體或異源多價抗體。

86、根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述融合蛋白為scfv-fc融合蛋白或scfv-fv融合蛋白。

87、在本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提出了一種核酸分子。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述核酸分子編碼前面所述的抗體或其抗原結(jié)合片段。根據(jù)本發(fā)明實施例的核酸分子所編碼的抗體或抗原結(jié)合片段可特異性靶向結(jié)合pdl1，阻斷pdl1和pd1結(jié)合。

88、根據(jù)本發(fā)明的實施例，上述核酸分子還可以進(jìn)一步包括如下附加技術(shù)特征至少之一：

89、根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述核酸分子為dna。

90、在本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明提出了一種表達(dá)載體。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述表達(dá)載體攜帶前面所述的核酸分子。根據(jù)本發(fā)明實施例的表達(dá)載體導(dǎo)入合適的受體細(xì)胞后，可在調(diào)控系統(tǒng)的介導(dǎo)下，有效實現(xiàn)前面所述的特異性結(jié)合pdl1的抗體或其抗原結(jié)合片段表達(dá)，進(jìn)而實現(xiàn)所述抗體或抗原結(jié)合片段的體外大量獲得。

91、根據(jù)本發(fā)明的實施例，上述表達(dá)載體還可以進(jìn)一步包括如下附加技術(shù)特征至少之一：

92、根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述表達(dá)載體為真核表達(dá)載體。進(jìn)而實現(xiàn)前面所述的特異性結(jié)合pdl1的抗體或其抗原結(jié)合片段在真核細(xì)胞中的表達(dá)，如cho細(xì)胞。

93、在一些實施方案中，所述表達(dá)載體為真核表達(dá)載體，例如包含常見真核表達(dá)啟動子原件的載體，包括cmv?promoter、sv40?promoter等。

94、根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述表達(dá)載體為原核表達(dá)載體。

95、在本發(fā)明的第四方面，本發(fā)明提出了一種重組細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述重組細(xì)胞攜帶前面所述的核酸分子，或者表達(dá)前面所述的抗體或其抗原結(jié)合片段。根據(jù)本發(fā)明實施例的重組細(xì)胞可用于前面所述的特異性結(jié)合pdl1的抗體或其抗原結(jié)合片段體外表達(dá)和大量獲得。

96、根據(jù)本發(fā)明的實施例，上述重組細(xì)胞還可以進(jìn)一步包括如下附加技術(shù)特征至少之一：

97、根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述重組細(xì)胞是通過將前面所述的表達(dá)載體引入至宿主細(xì)胞中而獲得的。

98、根據(jù)本發(fā)明的實施例，通過電轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法將所述表達(dá)載體引入所述宿主細(xì)胞中。

99、根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述重組細(xì)胞為真核細(xì)胞。

100、根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述重組細(xì)胞為哺乳動物細(xì)胞。

101、在本發(fā)明的第五方面，本發(fā)明提出了一種制備前面所述的抗體或其抗原結(jié)合片段的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，包括以下步驟：

102、(1)在所述的重組細(xì)胞中表達(dá)所述抗體或其抗原結(jié)合片段；和

103、(2)從所述的重組細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物中分離所述的抗體或其抗原結(jié)合片段。

104、在本發(fā)明的第六方面，本發(fā)明提出了一種雙特異性分子、免疫偶聯(lián)物、嵌合抗原受體、工程化t細(xì)胞受體或溶瘤病毒。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述雙特異性分子、免疫偶聯(lián)物、嵌合抗原受體、工程化t細(xì)胞受體或溶瘤病毒含有前面所述的抗體或其抗原結(jié)合片段。

105、在本發(fā)明的第七方面，本發(fā)明提出了一種藥物組合物。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述藥物組合物含有前面任一所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，前面任一所述的核酸分子，前面任一所述的表達(dá)載體或前面任一所述的重組細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明實施例的藥物組合物中所包含的抗體或表達(dá)的抗體不僅能夠特異性的靶向結(jié)合pdl1蛋白，有效阻斷pdl1和人源重組蛋白pd1的結(jié)合，而且可有效的結(jié)合人t細(xì)胞，有效刺激體外t細(xì)胞分泌il2及ifn-γ，有效逆轉(zhuǎn)體外treg細(xì)胞對cd4+t和cd8+t細(xì)胞的抑制作用。

106、在本發(fā)明的第八方面，本發(fā)明提出了前面任一所述的抗體或其抗原結(jié)合片段、前面任一所述的核酸分子、前面任一所述的表達(dá)載體或前面所述的重組細(xì)胞、前面任一所述的藥物組合物在制備藥物中的用途，所述藥物用于治療或者預(yù)防治療或者預(yù)防腫瘤、感染以及增強免疫力。

107、根據(jù)本發(fā)明的實施例，上述腫瘤為血液瘤或?qū)嶓w瘤，選自淋巴瘤、白血病、多發(fā)性骨髓瘤、黑素瘤、結(jié)腸腺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、胃腸癌、前列腺癌、膀胱癌、腎癌、卵巢癌、子宮頸癌、乳腺癌、肺癌、腎細(xì)胞癌、鼻咽癌或其任意組合。

108、根據(jù)本發(fā)明的實施例，上述感染選自病毒、細(xì)菌、真菌、寄生蟲等任何病原微生物所導(dǎo)致的任何感染。所述病毒的非限制性實例包括甲、乙、丙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒、人乳頭狀瘤病毒或皰疹病毒等；所述細(xì)菌的非限制性實例包括衣原體、分枝桿菌、葡萄球菌、鏈球菌、肺炎球菌、腦膜炎球菌等；所述真菌的非限制性實例包括毛癬菌屬、表皮癬菌屬、小孢子癬菌屬、白假絲酵母菌、新生隱球菌等；所述寄生蟲的非限制性實例包括瘧原蟲、血吸蟲、杜氏利什曼原蟲、絲蟲、鉤蟲等。

109、在本發(fā)明的第九方面，本發(fā)明提出了一種試劑盒。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述試劑盒包括前面任一所述的抗體或其抗原結(jié)合片段、前面任一所述的核酸分子、前面任一所述的表達(dá)載體、前面任一所述的重組細(xì)胞或前面任一所述的藥物組合物。

110、在某些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合片段帶有可檢測的標(biāo)記。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述試劑盒還包括第二抗體，其特異性識別本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合片段。優(yōu)選地，所述第二抗體還包括可檢測的標(biāo)記。

111、在本發(fā)明的第十方面，本發(fā)明提出了前面所述的抗體、前面所述的核酸分子、前面所述的表達(dá)載體或前面所述的重組細(xì)胞在制備試劑盒中的用途，所述試劑盒用于診斷或治療pdl1介導(dǎo)的相關(guān)疾病。

112、在一些實施方案中，所述試劑盒用于檢測pdl1在樣品中的存在或其水平。優(yōu)選地，所述pdl1是人pdl1。

113、在本發(fā)明的第十一方面，本發(fā)明提出了一種小鼠b細(xì)胞。

114、根據(jù)本發(fā)明實施例的小鼠b細(xì)胞可用于分泌鼠源pdl1抗體或制備pdl1單克隆抗體。

115、在對本發(fā)明描述的過程中，對于本文中有關(guān)的術(shù)語進(jìn)行了解釋和說明，這些解釋和說明僅僅是為了方便對于方案的理解，并不能看做是對本發(fā)明保護(hù)方案的限制。

116、抗體

117、本文中，術(shù)語“抗體”是能夠與特異性抗原結(jié)合的免疫球蛋白分子。通常包括兩條分子量較輕的輕鏈和兩條分子量較重的重鏈，重鏈(h鏈)和輕鏈(l鏈)由二硫鍵連接形成一個四肽鏈分子。其中，肽鏈的氨基端(n端)氨基酸序列變化很大，稱為可變區(qū)(v區(qū))，羧基端(c端)相對穩(wěn)定，變化很小，稱為恒定區(qū)(c區(qū))。l鏈和h鏈的v區(qū)分別稱為vl和vh。

118、在可變區(qū)中某些區(qū)域氨基酸組成和排列順序具有更高的變化程度，稱為高變區(qū)(hypervariable?region，hvr)，高變區(qū)為抗原和抗體結(jié)合的位置，因此也稱為決定簇互補區(qū)(complementarity-determining?region，cdr)。重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)上均有三個cdr區(qū)。cdr區(qū)序列可以由imgt、kabat、chothia和abm方法來定義或本領(lǐng)域熟知的任何cdr區(qū)序列確定方法而鑒定的可變區(qū)內(nèi)的氨基酸殘基。在某些實施方案中，本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合片段含有的cdr優(yōu)選地通過kabat、chothia或imgt編號系統(tǒng)確定。

119、術(shù)語“fc區(qū)”或“fc”是指免疫球蛋白重鏈的c端區(qū)，其含有鉸鏈區(qū)的至少一部分、ch2結(jié)構(gòu)域和ch3結(jié)構(gòu)域，其介導(dǎo)免疫球蛋白與宿主組織或因子的結(jié)合，包括與位于免疫系統(tǒng)的各種細(xì)胞(例如，效應(yīng)細(xì)胞)上的fc受體結(jié)合或與經(jīng)典補體系統(tǒng)的第一組分(例如c1q)結(jié)合，包括天然序列fc區(qū)和變異fc區(qū)。

120、術(shù)語“全長抗體”、“完整抗體”可互換使用，指基本上完整形式的抗體，與抗原結(jié)合片段不同。具體而言，完整抗體包括那些具有重鏈和輕鏈(包括fc區(qū))的。恒定區(qū)可以是天然序列恒定區(qū)(例如人天然序列恒定區(qū))或其氨基酸序列變體。在有些情況中，完整抗體可具有一項或多項效應(yīng)器功能。

121、術(shù)語“抗體片段”或“抗原結(jié)合片段”是指保留與抗原(如，pd1)特異性結(jié)合能力的抗體片段及抗體類似物，其通常包括至少部分母體抗體(parental?antibody)的抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)?？乖Y(jié)合片段包括但不限于：fab片段、fab’片段、f(ab’)2片段、fv片段、fd片段、互補決定區(qū)(cdr)片段、二硫鍵穩(wěn)定性蛋白(dsfv)等；線性抗體(linear?antibody)、單鏈抗體(例如scfv單抗體)(技術(shù)來自genmab)、二價單鏈抗體、單鏈?zhǔn)删w抗體、單域抗體(single?domain?antibody)(例如vh結(jié)構(gòu)域抗體)、結(jié)構(gòu)域抗體(技術(shù)來自abiynx)；由抗體片段形成的多特異性抗體(例如三鏈抗體、四鏈抗體等)；和工程改造抗體如嵌合抗體(chimeric?antibody)(例如人源化鼠抗體)、異綴合抗體(heteroconjugate?antibody)等。這些抗原結(jié)合片段用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)獲得，并用與完整抗體相同的方法對這些片段的實用性進(jìn)行篩選。

122、術(shù)語“單鏈抗體(或scfv抗體)”是指包含抗體的vh和vl結(jié)構(gòu)域的抗體片段，其中這些結(jié)構(gòu)域存在于單個多肽鏈中。

123、術(shù)語“單域抗體”用基因工程方法獲得，主要有3類，第一類是從駱駝科動物hcab獲得的重鏈可變區(qū)，為單一的折疊單元，保留了完整的抗原結(jié)合活性，是最小的天然抗體片段。第二類是從鯊魚等軟骨魚ignar獲得的重鏈可變區(qū)，用vnar表示。第三類是從人源或鼠源單抗獲得的重鏈或輕鏈可變區(qū)，保留了抗原結(jié)合活性，但親和性和可溶性大為下降。

124、術(shù)語“單克隆抗體(mab)”指獲自基本均一抗體群體的抗體，即除了少數(shù)出現(xiàn)可能的天然產(chǎn)生突變外，群體包含的單獨抗體是相同的，對特定表位顯示單一結(jié)合特異性和親和力。修飾語“單克隆”表示從實質(zhì)上一致的抗體組中獲得的抗體的性質(zhì)，不需要通過特定方法生產(chǎn)抗體。單克隆抗體由本領(lǐng)域技術(shù)人員所知曉的方法產(chǎn)生，例如通過將骨髓瘤細(xì)胞和免疫脾細(xì)胞融合制備雜合的抗體產(chǎn)生細(xì)胞。通過培養(yǎng)雜交瘤合成，不會污染任何其他抗體。單克隆抗體也可以用如重組技術(shù)、噬菌體展示技術(shù)、合成技術(shù)，或其他現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行重組得到。

125、術(shù)語“特異性結(jié)合”是指，兩分子間的非隨機的結(jié)合反應(yīng)，如抗體和其所針對的抗原之間的反應(yīng)。

126、本發(fā)明利用人源重組pdl1全長序列，通過多次免疫獲得了高特異性的高親和力的抗pdl1的fab(antigen-binding?fragment)抗體片段。利用該抗體片段能夠與pdl1特異性結(jié)合，從而可以抑制pdl1/pd1信號傳導(dǎo)。

127、在一些實施方案中，本發(fā)明提供了一種能夠特異性結(jié)合pdl1的抗體或者抗原結(jié)合片段，所述抗體含有選自下列至少之一的cdr序列或與其具有至少95％同一性的氨基酸序列：重鏈可變區(qū)cdr序列：seq?id?no:1～13；輕鏈可變區(qū)cdr序列：seq?in?no:14～27。在一些實施方案中，本發(fā)明還提供了一種抗體或抗原結(jié)合片段，所述抗體或抗原結(jié)合片段具有seq?id?no：28～32任一項所示氨基酸序列的重鏈可變區(qū)或具有如seq?id?no：33～37任一項所示氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。在另一些實施方案中，本發(fā)明所提供的抗體或者抗原結(jié)合片段與上述序列相比，具有保守氨基酸取代。術(shù)語“保守氨基酸取代”指的是氨基酸被另一氨基酸發(fā)生生物學(xué)上、化學(xué)上或者結(jié)構(gòu)上相似的殘基所取代。生物學(xué)上相似的指的是該取代不破壞pdl1抗體或者與pdl1蛋白結(jié)合的生物學(xué)活性。結(jié)構(gòu)上相似指的是氨基酸具有相似長度的側(cè)鏈，如丙氨酸、甘氨酸或絲氨酸，或具有相似大小的側(cè)鏈?；瘜W(xué)相似性指的是氨基酸具有相同的荷電或者都是親水或者疏水的。例如疏水殘基異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸或者甲硫氨酸相互取代?；蛘邩O性氨基酸相互取代，例如用精氨酸取代賴氨酸、谷氨酸取代天冬氨酸、谷氨酰胺取代天冬酰胺，絲氨酸取代蘇氨酸等等。在一些具體方式中，這些保守氨基酸取代可以發(fā)生在重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)中除了cdr區(qū)之外的氨基酸上。

128、在一些優(yōu)選方案中，本發(fā)明提供了一種抗pdl1抗體，該抗體具有seq?id?no:38～42任一項所示氨基酸序列的重鏈和具有seq?id?no:43～47任一項所示氨基酸序列的輕鏈。

129、術(shù)語“同一性”用于指兩個多肽之間或兩個核酸之間的序列相似程度。當(dāng)兩個進(jìn)行比較的序列中的某個位置都被相同的堿基或氨基酸單體亞單元占據(jù)時(例如，兩個dna分子的每一個中的某個位置都被腺嘌呤占據(jù)，或兩個多肽的每一個中的某個位置都被賴氨酸占據(jù))，那么各分子在該位置上是同一的。兩個序列之間的“百分?jǐn)?shù)同一性”是由這兩個序列共有的匹配位置數(shù)目除以進(jìn)行比較的位置數(shù)目×100的函數(shù)。例如，如果兩個序列的10個位置中有6個匹配，那么這兩個序列具有60％的同一性。

130、術(shù)語“pdl1-fc融合蛋白”是一種通過dna重組得到的pdl1胞外區(qū)和人抗體fc兩個基因共同表達(dá)的蛋白產(chǎn)物。pdl1胞外區(qū)是指pdl1蛋白表達(dá)在細(xì)胞膜以外的部分。

131、核酸分子、表達(dá)載體、重組細(xì)胞

132、術(shù)語“核酸分子”包括dna分子和rna分子。核酸分子可以是單鏈或雙鏈的，并且可以是cdna。

133、術(shù)語“載體”是指任何重組多核苷酸構(gòu)建體，其可用于轉(zhuǎn)化的目的，即將異源dna引入到宿主細(xì)胞中，可以為質(zhì)粒(例如plasmid-x質(zhì)粒)、病毒(例如，復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒，腺病毒和腺伴隨病毒)、噬菌體等。

134、術(shù)語“表達(dá)載體”是指在轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)至宿主細(xì)胞中時能夠復(fù)制及表達(dá)感興趣基因的核酸分子。表達(dá)載體包含一個或多個表型選擇標(biāo)志及復(fù)制起點，以確保維持載體及以在需要的情況下于宿主內(nèi)提供擴增。表達(dá)載體進(jìn)一步包含啟動子，以驅(qū)動細(xì)胞內(nèi)多肽的表達(dá)。

135、術(shù)語“重組細(xì)胞”是指經(jīng)表達(dá)載體引入其中的細(xì)胞。

136、在制備或者獲取這些抗體的過程中，可以利用表達(dá)這些抗體的核酸分子，與不同的載體連接，然后在不同細(xì)胞中表達(dá)，來獲得相應(yīng)抗體。

137、為此，本發(fā)明還提供了一種分離的核酸分子，所述核酸分子編碼上述所述的抗體或抗原結(jié)合片段。

138、本發(fā)明還提供了一種表達(dá)載體，所述表達(dá)載體包含上述分離的核酸分子。在將上述分離的多核苷酸連接到載體上時，可以將多核苷酸與載體上的控制組件直接或者間接相連，只要這些控制組件能夠控制多核苷酸的翻譯和表達(dá)等即可。當(dāng)然這些控制組件可以直接來自于載體本身，也可以是外源性的，即并非來自于載體本身。當(dāng)然，多核苷酸與控制組件進(jìn)行可操作地連接即可。本文中“可操作地連接”是指將外源基因連接到載體上，使得載體內(nèi)的控制組件，例如轉(zhuǎn)錄控制序列和翻譯控制序列等等，能夠發(fā)揮其預(yù)期的調(diào)節(jié)外源基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯的功能。當(dāng)然用來編碼抗體重鏈和輕鏈的多核苷酸，可以分別獨立的插入到不同的載體上，常見的是插入到同一載體上。

139、本發(fā)明還提供了一種重組細(xì)胞，該重組細(xì)胞中包含有該表達(dá)載體?？梢詫⒈磉_(dá)載體導(dǎo)入到哺乳動物細(xì)胞中，構(gòu)建獲得重組細(xì)胞，然后利用這些重組細(xì)胞表達(dá)本發(fā)明提供的抗體或者抗原結(jié)合片段。通過該重組細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，即可以獲得相應(yīng)抗體。這些可用的哺乳動物細(xì)胞例如可以為cho細(xì)胞等。

140、藥物組合物、試劑盒及制藥用途和在制備試劑盒中的用途。

141、本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，所述藥物組合物包括上述所述的抗體或者抗原結(jié)合片段和藥學(xué)可接受的載體。

142、本文提供的抗pdl1抗體可以摻入適合受試者施用的藥物組合物中。通常，這些藥物組合物包括本文提供的抗pdl1抗體以及藥學(xué)上可接受的載體?！八帉W(xué)上可接受的載體”可以包括生理學(xué)上兼容的任何和所有溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗細(xì)菌劑和抗真菌劑、等滲劑和延遲吸收劑等等。具體實例可以是水、鹽水、磷酸鹽緩沖鹽水、葡萄糖、甘油、乙醇等以及它們的組合物中的一種或多種。有許多情況下，藥物組合物中包括等滲劑，例如糖類、多元醇(如甘露醇、山梨醇)或氯化鈉等。當(dāng)然藥學(xué)上可接受的載體還可包括微量的輔助物質(zhì)，例如潤濕劑或乳化劑、防腐劑或緩沖劑，用來延長抗體的保存限期或效力。

143、例如，本發(fā)明的抗體可摻入適用于胃腸外施用(例如靜脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi))的藥物組合物中。這些藥物組合物可以被制備成各種形式。例如液體、半固體和固體劑型等，包括但不限于液體溶液(例如，注射溶液和輸注溶液)、分散劑或懸浮劑、片劑、丸劑、粉末、脂質(zhì)體和栓劑。典型的藥物組合物為注射溶液或輸注溶液形式。所述抗體可通過靜脈輸注或注射或肌肉內(nèi)或皮下注射來施用。

144、當(dāng)然，本文中的抗pdl1抗體還可以根據(jù)需要被制成試劑盒或者其他診斷性試劑的一部分。根據(jù)本發(fā)明的實施例，本發(fā)明還提供了一種試劑盒，所述試劑盒包括上述pdl1抗體。應(yīng)用本發(fā)明提供的試劑盒，例如可以用于免疫印跡、免疫沉淀等涉及到利用抗原和抗體特異性結(jié)合性能，來檢測的試劑盒等。

145、在利用本發(fā)明所提供的抗pdl1抗體治療pdl1介導(dǎo)的疾病時，可以將本發(fā)明提供的抗pdl1抗體或其抗原結(jié)合片段提供給受試者即可。為此，本發(fā)明提供了一種用于治療上述疾病的方法，包括向有需要的受試者施用本發(fā)明所提供的的抗體或其抗原結(jié)合片段或上述藥物組合物。