本發(fā)明總體上涉及異二聚體fc融合蛋白和包含此類蛋白質(zhì)的藥物組合物、以及在治療人類患者的疾病或障礙中的使用方法。

背景技術(shù)：

1、生理活性蛋白大多具有體內(nèi)半衰期短的缺點。為了解決該缺點，已經(jīng)嘗試將它們與peg(聚乙二醇)等綴合，或者將它們與抗體fc(可結(jié)晶片段)區(qū)域融合。由兩個或更多個不同亞基構(gòu)成的蛋白質(zhì)(其中所述兩個或更多個不同亞基形成蛋白質(zhì)復(fù)合物以表現(xiàn)出生理活性)可以與野生型fc結(jié)構(gòu)域融合以制備fc融合蛋白形式，由于fc的同二聚體性質(zhì)，從而形成同二聚體。由兩個或更多個不同亞基構(gòu)成的蛋白質(zhì)(其中所述兩個或更多個不同亞基形成蛋白質(zhì)復(fù)合物以表現(xiàn)出生理活性)也可以與不僅源自igg1而且源自其他同種型抗體(如igg2、igg3和igg4)的異二聚體fc區(qū)融合，以形成異二聚體fc融合蛋白。因此，由兩個或更多個不同亞基構(gòu)成并且其中兩個或更多個亞基通過形成蛋白質(zhì)復(fù)合物而表現(xiàn)出生理活性的蛋白質(zhì)的一個或更多個亞基可以與異二聚體fc變體區(qū)域的末端融合，以形成改進的fc融合蛋白形式。

2、fc異二聚化是這樣一種技術(shù)，其通過基因工程在fc的兩個不同ch3結(jié)構(gòu)域中誘導(dǎo)突變，使得這兩個fc片段形成具有最小序列變異的異二聚體，同時它們具有與天然存在的抗體的三級結(jié)構(gòu)非常類似的三級結(jié)構(gòu)(參見例如，美國專利號7,695,936)。

3、在本公開文本中描述的發(fā)明提供了用于改進fc融合蛋白形式的設(shè)計，其中通過在fc的ch2和ch3結(jié)構(gòu)域中引入不同長度的接頭或突變，異二聚體蛋白的兩個亞基與具有不同異二聚化結(jié)構(gòu)域的兩個fc結(jié)構(gòu)域連接。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明總體上涉及異二聚體fc融合蛋白和包含此類蛋白質(zhì)的藥物組合物。

2、在一個方面，本發(fā)明提供了一種異二聚體fc融合蛋白，所述融合蛋白包含第一多肽，其包含第一抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽和多亞基蛋白的第一亞基；以及第二多肽，其包含第二抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽和所述多亞基蛋白的第二不同亞基，其中所述第一抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽和所述第二抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽各自包含促進異二聚化的不同突變，其中所述第一抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽和/或所述第二抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽包含降低fc的效應(yīng)子功能的一個或多個突變，并且其中所述多亞基蛋白的第一亞基和第二不同亞基彼此結(jié)合。

3、在一些實施方案中，所述效應(yīng)子功能包括fc結(jié)構(gòu)域多肽誘導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞毒性(adcc)、抗體依賴性細(xì)胞吞噬(adcp)和/或補體依賴性細(xì)胞毒性(cdc)的能力。在一些實施方案中，所述第一抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽和所述第二抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽是人抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽。在一些實施方案中，所述第一抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽和所述第二抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽是igg1、igg2、igg3、igg4、igm、iga、igd或ige?fc結(jié)構(gòu)域多肽(例如，人igg1、igg2、igg3、igg4、igm、iga、igd或ige?fc結(jié)構(gòu)域多肽)。在一些實施方案中，所述第一抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽和/或所述第二抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽包含在根據(jù)eu編號的一個或多個位置233、234、235、236、237、297、318、320、322、329、330和/或331處的一個或多個突變。在一些實施方案中，所述異二聚體fc融合蛋白是巖藻糖基化的。

4、在一些實施方案中，所述第一抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽和所述第二抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽是人igg1?fc結(jié)構(gòu)域多肽。在一些實施方案中，所述第一抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽和/或所述第二抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽包含在根據(jù)eu編號的一個或多個位置234、235、237、329、330和/或331處的一個或多個突變。在一些實施方案中，所述第一抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽和/或所述第二抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽包含選自234a、l235a、l235e、g237a、p329a、a330s和p331s的一個或多個突變。在一些實施方案中，所述第一抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽和所述第二抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽各自包含突變l234a和l235a。在一些實施方案中，所述第一抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽和所述第二抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽各自包含突變l234a、l235a和p329a。在一些實施方案中，所述第一抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽和所述第二抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽各自包含突變l234a、l235e、g237a、a330s和p331s。在一些實施方案中，所述第一抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽和所述第二抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽各自包含突變c220s。

5、在一些實施方案中，所述第一抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽和所述第二抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽是人igg4?fc結(jié)構(gòu)域多肽。在一些實施方案中，所述第一抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽和/或所述第二抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽包含在根據(jù)eu編號的一個或多個位置235和/或329處的一個或多個突變。在一些實施方案中，所述第一抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽和/或所述第二抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽包含選自l235e和p329a的一個或多個突變。在一些實施方案中，所述第一抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽和所述第二抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽各自包含突變l235e。在一些實施方案中，所述第一抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽和所述第二抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽各自包含突變l235e和p329a。在一些實施方案中，所述第一抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽和所述第二抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽各自包含突變s228p。

6、在另一個方面，本發(fā)明提供了一種異二聚體fc融合蛋白，所述融合蛋白包含第一多肽，其包含seq?id?no:290的氨基酸序列；以及第二多肽，其包含seq?id?no:291的氨基酸序列。

7、在又另一個方面，本發(fā)明提供了一種多肽，其包含多亞基細(xì)胞因子的亞基和免疫球蛋白fc結(jié)構(gòu)域多肽；所述fc結(jié)構(gòu)域多肽包含用于促進與不同免疫球蛋白fc結(jié)構(gòu)域多肽的異二聚化的突變和降低fc的效應(yīng)子功能的一個或多個突變。例如，包含所述突變的fc結(jié)構(gòu)域多肽可以是人igg1抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽。

8、在一些實施方案中，降低fc的效應(yīng)子功能的所述一個或多個突變選自l234a、l235a或l235e、g237a、p329a、a330s和p331s，根據(jù)eu編號系統(tǒng)進行編號。例如，在一些實施方案中，降低fc的效應(yīng)子功能的所述突變是l234a、l235a和p329a，根據(jù)eu編號系統(tǒng)進行編號。

9、在一些實施方案中，用于促進異二聚化的所述突變是k360e和k409w，根據(jù)eu編號系統(tǒng)進行編號。在一些其他實施方案中，用于促進異二聚化的所述突變是q347r、d399v和f405t，根據(jù)eu編號系統(tǒng)進行編號。

10、在一些實施方案中，所述fc結(jié)構(gòu)域多肽還包含用于促進與不同免疫球蛋白fc結(jié)構(gòu)域多肽形成二硫鍵的突變。例如，當(dāng)所述異二聚化突變是k360e和k409w時，在一些實施方案中，用于促進二硫鍵形成的所述突變是y349c，根據(jù)eu編號系統(tǒng)進行編號。當(dāng)所述異二聚化突變是q347r、d399v和f405t時，在一些實施方案中，用于促進二硫鍵形成的所述突變是s354c，根據(jù)eu編號系統(tǒng)進行編號。

11、例如，在一些實施方案中，包含多亞基細(xì)胞因子的亞基和免疫球蛋白fc結(jié)構(gòu)域多肽的多肽包含seq?id?no:290的氨基酸序列或seq?id?no:291的氨基酸序列。

12、在另一個方面，本發(fā)明提供了一種核酸，其編碼包含seq?id?no:290或seq?id?no:291的氨基酸序列的多肽。在又另一個方面，本發(fā)明提供了一種表達載體，其包含核酸，所述核酸包含編碼包含seq?id?no:290或seq?id?no:291的氨基酸序列的多肽的序列。在一個方面，本發(fā)明提供了一種細(xì)胞，其包含核酸，所述核酸編碼包含seq?id?no:290或seq?id?no:291的氨基酸序列的多肽；或表達載體，所述表達載體包含核酸，所述核酸包含編碼包含seqid?no:290或seq?id?no:291的氨基酸序列的多肽的序列。

13、在另一個方面，本發(fā)明提供了一種異二聚體fc融合蛋白，其包含免疫球蛋白fc的第一fc結(jié)構(gòu)域多肽和第二不同fc結(jié)構(gòu)域多肽、以及多亞基蛋白的第一亞基和第二不同亞基，其中所述第一亞基和所述第二不同亞基彼此結(jié)合并連接至所述第一fc結(jié)構(gòu)域多肽和/或所述第二不同fc結(jié)構(gòu)域多肽的n末端或c末端的一個或多個末端；其中所述第一fc結(jié)構(gòu)域多肽和所述第二fc結(jié)構(gòu)域多肽被突變以便促進異二聚體fc形成并降低fc的效應(yīng)子功能。在一些實施方案中，所述多亞基蛋白是il-12(例如，人il-12)，使得在異二聚體fc融合蛋白中，il-12的p35和p40亞基彼此結(jié)合并連接至所述第一fc結(jié)構(gòu)域多肽和/或所述第二fc結(jié)構(gòu)域多肽的n末端或c末端的一個或多個末端；其中所述第一fc結(jié)構(gòu)域多肽和所述第二fc結(jié)構(gòu)域多肽被突變以便促進異二聚體fc形成并降低fc的效應(yīng)子功能。

14、在一個方面，本發(fā)明提供了一種異二聚體fc融合蛋白，所述融合蛋白包含：第一多肽，其包含第一抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽；以及第二多肽，其包含與所述第一抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽結(jié)合的第二抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽，其中所述第一多肽還包含多亞基蛋白的第一亞基，所述第一亞基通過包含氨基酸序列pkssdkthtcppcpapex1x2gx3(seq?id?no：237)或epkssdkthtcppcpapex1x2gx3(seq?id?no：6)的接頭與所述第一抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽融合，其中x1表示l或a，x2表示l、e或a，并且x3表示a或g；所述多亞基蛋白的第二不同亞基與所述第二抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽融合，并且所述多亞基蛋白的亞基彼此結(jié)合；當(dāng)x1表示l和/或x2表示l時，所述第一抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽和所述第二抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽中的至少一種包含用于促進異二聚化的q347r突變。

15、在一些實施方案中，在所述異二聚體fc融合蛋白內(nèi)，連接所述多亞基蛋白的第一亞基與所述第一抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽的接頭包含氨基酸序列pkssdkthtcppcpapeaagg(seqid?no：239)或epkssdkthtcppcpapeaagg(seq?id?no：9)。在一些實施方案中，在所述異二聚體fc融合蛋白內(nèi)，連接所述多亞基蛋白的第一亞基與所述第一抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽的接頭由氨基酸序列pkssdkthtcppcpapeaagg(seq?id?no：239)或epkssdkthtcppcpapeaagg(seq?idno：9)組成。

16、在一些實施方案中，在所述異二聚體fc融合蛋白內(nèi)，所述多亞基蛋白的第二不同亞基通過接頭與所述第二抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽融合，所述接頭包含氨基酸序列g(shù)gggsggggsggggsepkssdkthtcppcpapeaagg(seq?id?no：10)或ggggsggggsggggspkssdkthtcppcpapeaagg(seq?id?no：244)。在一些實施方案中，所述多亞基蛋白的第二不同亞基通過接頭與所述第二抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽融合，所述接頭由氨基酸序列g(shù)gggsggggsggggsepkssdkthtcppcpapeaagg(seq?id?no：10)或ggggsggggsggggspkssdkthtcppcpapeaagg(seq?id?no：244)組成。

17、在一些實施方案中，在所述異二聚體fc融合蛋白內(nèi)，連接所述多亞基蛋白的第一亞基與所述第一抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽的接頭包含氨基酸序列pkssdkthtcppcpapellgg(seqid?no：238)或epkssdkthtcppcpapellgg(seq?id?no：7)。在一些實施方案中，在所述異二聚體fc融合蛋白內(nèi)，將所述多亞基蛋白的第一亞基與所述第一抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽融合的接頭由氨基酸序列pkssdkthtcppcpapekkgg(seq?id?no：238)或epkssdkthtcppcpapellgg(seqid?no：7)組成。

18、在一些實施方案中，在所述異二聚體fc融合蛋白內(nèi)，所述多亞基蛋白的第二不同亞基通過接頭與所述第二抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽融合，所述接頭包含氨基酸序列g(shù)gggsggggsggggsepkssdkthtcppcpapellgg(seq?id?no：8)或ggggsggggsggggspkssdkthtcppcpapellgg(seq?id?no：241)。在一些實施方案中，所述多亞基蛋白的第二不同亞基通過接頭與所述第二抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽融合，所述接頭由氨基酸序列g(shù)gggsggggsggggsepkssdkthtcppcpapellgg(seq?id?no：8)或ggggsggggsggggspksskdthtcppcpapellgg(seq?id?no：241)組成。

19、在一些實施方案中，在所述異二聚體fc融合蛋白內(nèi)，所述多亞基蛋白的第二不同亞基通過接頭與所述第二抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽融合，所述接頭包含氨基酸序列g(shù)gggsepksskdthtcppcpapellgg(seq?id?no：15)或ggggspkssdkthtcppcpapellgg(seq?idno：242)。在一些實施方案中，所述多亞基蛋白的第二不同亞基通過接頭與所述第二抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽融合，所述接頭由氨基酸序列g(shù)gggsepkssdkthtcppcpapellgg(seq?idno：15)或ggggspkssdkthtcppcpapellgg(seq?id?no：242)組成。

20、在一些實施方案中，在所述異二聚體fc融合蛋白內(nèi)，所述多亞基蛋白的第二不同亞基通過接頭與所述第二抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽融合，所述接頭包含氨基酸序列g(shù)gggsggggsepkssdkthtcppcpapellgg(seq?id?no：16)或ggggsggggspkssdkthtcppcpapellgg(seq?idno：243)。在一些實施方案中，所述多亞基蛋白的第二不同亞基通過接頭與所述第二抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽融合，所述接頭由氨基酸序列g(shù)gggsggggsepkssdkthtcppcpapellgg(seq?idno：16)或ggggsggggspkssdkthtcppcpapellgg(seq?id?no：243)組成。

21、在一些實施方案中，在所述異二聚體fc融合蛋白內(nèi)，所述多亞基蛋白的第二不同亞基通過接頭與所述第二抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽融合，所述接頭包含氨基酸序列g(shù)gggsepkssdkthtcppcpapeaagg(seq?id?no：64)或ggggspkssdkthtcppcpapeaagg(seq?idno：245)。在一些實施方案中，所述多亞基蛋白的第二不同亞基通過接頭與所述第二抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽融合，所述接頭由氨基酸序列g(shù)gggsepkssdkthtcppcpapeaagg(seq?id?no：65)或ggggspkssdkthtcppcpapeaagg(seq?id?no：245)組成。

22、在一些實施方案中，在所述異二聚體fc融合蛋白內(nèi)，所述多亞基蛋白的第二不同亞基通過接頭與所述第二抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽融合，所述接頭包含氨基酸序列g(shù)gggsggggsepkssdkthtcppcpapeaagg(seq?id?no：66)或ggggsggggspkssdkthtcppcpapeaagg(seq?idno：246)。在一些實施方案中，所述多亞基蛋白的第二不同亞基通過接頭與所述第二抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽融合，所述接頭由氨基酸序列g(shù)gggsggggsepkssdkthtcppcpapeaagg(seq?idno：66)或ggggsggggspkssdkthtcppcpapeaagg(seq?id?no：246)組成。

23、在一些實施方案中，在所述異二聚體fc融合蛋白內(nèi)，連接所述多亞基蛋白的第一亞基與所述第一抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽的接頭包含氨基酸序列epkssdkthtcppcpapeaega(seqid?no：246)或pkssdkthtcppcpapeaega(seq?id?no：240)。在一些實施方案中，在所述異二聚體fc融合蛋白內(nèi)，將所述多亞基蛋白的第一亞基與所述第一抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽融合的接頭由氨基酸序列epkssdkthtcppcpapeaega(seq?id?no：11)或pkssdkthtcppcpapeaega(seqid?no：240)組成。

24、在一些實施方案中，在所述異二聚體fc融合蛋白內(nèi)，所述多亞基蛋白的第二不同亞基通過接頭與所述第二抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽融合，所述接頭包含氨基酸序列g(shù)gggsggggsggggsepkssdkthtcppcpapeaega(seq?id?no：12)或ggggsggggsggggspkssdkthtcppcpapeaega(seq?id?no：247)。在一些實施方案中，所述多亞基蛋白的第二不同亞基通過接頭與所述第二抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽融合，所述接頭由氨基酸序列g(shù)gggsggggsggggsepkssdkthtcppcpapeaega(seq?id?no：12)或ggggsggggsggggspkssdkthtcppcpapeaega(seq?id?no：247)組成。

25、在一些實施方案中，在所述異二聚體fc融合蛋白內(nèi)，所述多亞基蛋白的第二不同亞基通過接頭與所述第二抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽融合，所述接頭包含氨基酸序列g(shù)gggsepkssdkthtcppcpapeaega(seq?id?no：67)或ggggspkssdkthtcppcpapeaega(seq?idno：248)。在一些實施方案中，所述多亞基蛋白的第二不同亞基通過接頭與所述第二抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽融合，所述接頭由氨基酸序列g(shù)gggsepkssdkthtcppcpapeaega(seq?id?no：67)或ggggspkssdkthtcppcpapeaega(seq?id?no：248)組成。

26、在一些實施方案中，在所述異二聚體fc融合蛋白內(nèi)，所述多亞基蛋白的第二不同亞基通過接頭與所述第二抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽融合，所述接頭包含氨基酸序列g(shù)gggsggggsepkssdkthtcppcpapeaega(seq?id?no：68)或ggggsggggspkssdkthtcppcpapeaega(seq?idno:249)。在一些實施方案中，所述多亞基蛋白的第二不同亞基通過接頭與所述第二抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽融合，所述接頭由氨基酸序列g(shù)gggsggggsepkssdkthtcppcpapeaega(seq?idno:68)或ggggsggggspkssdkthtcppcpapeaega(seq?id?no:249)組成。

27、在另一個方面，本發(fā)明提供了一種異二聚體fc融合蛋白，所述融合蛋白包含多亞基細(xì)胞因子的亞基，所述亞基通過接頭與免疫球蛋白fc結(jié)構(gòu)域多肽連接，所述接頭包含氨基酸序列pkssdkthtcppcpapeaagg(seq?id?no：239)；所述fc結(jié)構(gòu)域多肽包含用于促進與不同免疫球蛋白fc結(jié)構(gòu)域多肽的異二聚化的突變、以及用于降低fc的效應(yīng)子功能的l234a、l235a和p329a取代。

28、在一些實施方案中，本發(fā)明提供了一種異二聚體fc融合蛋白，所述融合蛋白包含人il-12的p40亞基，所述亞基通過接頭與第一人igg1(higg1)fc結(jié)構(gòu)域多肽連接，所述接頭包含氨基酸序列pkssdkthtcppcpapeaagg(seq?id?no:239)或由其組成；以及人il-12的p35亞基，所述亞基通過接頭與第二higg1?fc結(jié)構(gòu)域多肽連接，所述接頭包含氨基酸序列g(shù)gggsggggsggggsepkssdkthtcppcpapeaagg(seq?id?no：10)或由其組成；所述第一fc結(jié)構(gòu)域多肽和所述第二fc結(jié)構(gòu)域多肽包含促進異二聚化的突變、以及用于降低higg1?fc的效應(yīng)子功能的l234a、l235a和p329a取代。

29、在一個方面，本發(fā)明提供了一種異二聚體fc融合蛋白，所述融合蛋白包含：第一多肽，其包含第一抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽；以及第二多肽，其包含第二抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽，其中所述第一多肽還包含多亞基蛋白的第一亞基，其中所述蛋白質(zhì)序列通過接頭與所述第一抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽融合，所述接頭包含氨基酸序列rveskygppcppcpapefxgg(seq?id?no:1)，其中x表示l或e；所述多亞基蛋白的第二不同亞基與所述第二抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽融合，并且所述多亞基蛋白的亞基彼此結(jié)合，所述第一抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽和所述第二抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽各自含有促進異二聚化的不同突變，并且所述第一抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽和所述第二抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽彼此結(jié)合。

30、在一些實施方案中，本發(fā)明的異二聚體fc融合蛋白包含第一多肽，其包含第一抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽；以及第二多肽，其包含第二抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽，其中所述第一多肽還包含多亞基蛋白的第一亞基，其中所述蛋白質(zhì)序列通過接頭與所述第一抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽融合；并且所述第二多肽還包含多亞基蛋白的第二不同亞基，其中所述蛋白質(zhì)序列通過接頭與所述第二抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽融合。連接多亞基蛋白的所述第二不同亞基的蛋白質(zhì)序列與所述第二抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽的接頭可以包括g4s(seq?id?no:110)、(g4s)2(seq?id?no:109)或(g4s)3(seq?id?no:108)。

31、在一些實施方案中，在所述異二聚體fc融合蛋白內(nèi)，連接所述多亞基蛋白的亞基與所述第一抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽的接頭包含氨基酸序列rveskygppcppcpapefkgg(seq?idno：2)。在一些實施方案中，將所述多亞基蛋白的第一亞基與所述第一抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽融合的接頭由氨基酸序列rveskygppcppcpapeflgg(seq?id?no：2)組成。

32、在一些實施方案中，所述多亞基蛋白的第二不同亞基通過接頭與所述第二抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽融合，所述接頭包含氨基酸序列g(shù)gggsggggsggggsrveskygppcppcpapeflgg(seqid?no：3)。在一些實施方案中，所述多亞基蛋白的第二不同亞基通過接頭與所述第二抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽融合，所述接頭由氨基酸序列g(shù)gggsggggsggggsrveskygppcppcpapeflgg(seqid?no：3)組成。

33、在一些實施方案中，所述多亞基蛋白的第二不同亞基通過接頭與所述第二抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽融合，所述接頭包含氨基酸序列g(shù)gggsrveskygppcppcpapeflgg(seq?id?no：13)。在一些實施方案中，所述多亞基蛋白的第二不同亞基通過接頭與所述第二抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽融合，所述接頭由氨基酸序列g(shù)gggsrveskygppcppcpapeflgg(seq?id?no：13)組成。

34、在一些實施方案中，所述多亞基蛋白的第二不同亞基通過接頭與所述第二抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽融合，所述接頭包含氨基酸序列g(shù)gggsggggsrveskygppcppcpapeflgg(seq?idno：14)。在一些實施方案中，所述多亞基蛋白的第二不同亞基通過接頭與所述第二抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽融合，所述接頭由氨基酸序列g(shù)gggsggggsrveskygppcppcpapeflgg(seq?id?no:14)組成。

35、在一些實施方案中，在所述異二聚體fc融合蛋白內(nèi)，連接所述多亞基蛋白的亞基與所述第一抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽的接頭包含氨基酸序列rveskygppcppcpapefegg(seq?idno:4)。在一些實施方案中，將所述多亞基蛋白的第一亞基與所述第一抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽融合的接頭由氨基酸序列rveskygppcppcpapefegg(seq?id?no:4)組成。

36、在一些實施方案中，所述多亞基蛋白的第二不同亞基通過接頭與所述第二抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽融合，所述接頭包含氨基酸序列g(shù)gggsggggsggggsrveskygppcppcpapefegg(seqid?no：5).。在一些實施方案中，所述多亞基蛋白的第二不同亞基通過接頭與所述第二抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽融合，所述接頭由氨基酸序列g(shù)gggsggggsggggsrveskygppcppcpapefegg(seqid?no:5)組成。

37、在一些實施方案中，所述多亞基蛋白的第二不同亞基通過接頭與所述第二抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽融合，所述接頭包含氨基酸序列g(shù)gggsrveskygppcppcapefegg(seq?id?no:63)。在一些實施方案中，所述多亞基蛋白的第二不同亞基通過接頭與所述第二抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽融合，所述接頭由氨基酸序列g(shù)gggsrveskygppcppcpapefegg(seq?id?no：63)組成。

38、在一些實施方案中，所述多亞基蛋白的第二不同亞基通過接頭與所述第二抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽融合，所述接頭包含氨基酸序列g(shù)gggsggggsrveskygppcppcpapefegg(seq?idno：64)。在一些實施方案中，所述多亞基蛋白的第二不同亞基通過接頭與所述第二抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽融合，所述接頭由氨基酸序列g(shù)gggsggggsrveskygppcppcpapefegg(seq?id?no：64)組成。

39、本文所述的一些異二聚體fc融合蛋白包括第一igg4抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽和第二不同igg4抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽，其各自被突變以促進與彼此的異二聚化。在一些實施方案中，所述第一igg4抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽包括選自k370e和r409w的一個或多個突變，并且所述第二不同igg4抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽包括選自e357n、d399v和f405t的一個或多個突變。在一些實施方案中，所述第一igg4抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽包括選自e357n、d399v和f405t的一個或多個突變，并且所述第二不同igg4抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽包括選自k370e和r409w的一個或多個突變。在一些實施方案中，所述第一igg4抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽包括突變k370e和r409w，并且所述第二不同igg4抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽包括突變e357n、d399v和f405t。在一些實施方案中，所述第一igg4抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽包括突變e357n、d399v和f405t，并且所述第二不同igg4抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽包括突變k370e和r409w。在一些實施方案中，所述第一igg4fc結(jié)構(gòu)域多肽包括選自k360e和r409w的一個或多個突變，并且所述第二不同igg4?fc結(jié)構(gòu)域多肽包括選自q347r、d399v和f405t的一個或多個突變。在一些實施方案中，所述第一igg4?fc結(jié)構(gòu)域多肽包括選自q347r、d399v和f405t的一個或多個突變，并且所述第二不同igg4?fc結(jié)構(gòu)域多肽包括選自k360e和r409w的一個或多個突變。在一些實施方案中，所述第一igg4?fc結(jié)構(gòu)域多肽包括突變k360e和r409w，并且所述第二不同igg4?fc結(jié)構(gòu)域多肽包括突變q347r、d399v和f405t。在一些實施方案中，所述第一igg4?fc結(jié)構(gòu)域多肽包括突變q347r、d399v和f405t，并且所述第二不同igg4?fc結(jié)構(gòu)域多肽包括突變k360e和r409w。

40、本文公開的一些異二聚體fc融合蛋白包括第一igg1抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽和第二不同igg1抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽，其各自被突變以促進與彼此的異二聚化。在一些實施方案中，所述第一igg1?fc結(jié)構(gòu)域多肽包括選自k360e和k409w的一個或多個突變，并且所述第二不同igg1?fc結(jié)構(gòu)域多肽包括選自q347r、d399v和f405t的一個或多個突變。在一些實施方案中，所述第一igg1?fc結(jié)構(gòu)域多肽包括選自q347r、d399v和f405t的一個或多個突變，并且所述第二不同igg1?fc結(jié)構(gòu)域多肽包括選自k360e和k409w的一個或多個突變。在一些實施方案中，所述第一igg1抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽包括突變k360e和k409w，并且所述第二不同igg1抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽包括突變q347r、d399v和f405t。在一些實施方案中，所述第一igg1抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽包括突變q347r、d399v和f405t，并且所述第二不同igg1抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽包括突變k360e和k409w。

41、在一些實施方案中，本文所述的異二聚體fc融合蛋白包含進一步突變以降低效應(yīng)子功能的igg4或igg1?fc結(jié)構(gòu)域多肽。在一些實施方案中，所述第一抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽和所述第二抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽各自含有突變p329g或p329a。在一些實施方案中，所述第一igg4抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽和所述第二不同igg4抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽各自含有突變p329g或p329a。在一些實施方案中，所述第一igg1抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽和所述第二不同igg1抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽各自含有突變p329g或p329a。在一些實施方案中，所述第一igg4抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽和所述第二不同igg4抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽各自含有突變p329a。在一些實施方案中，所述第一igg1抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽和所述第二不同igg1抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽各自含有突變p329a。

42、在一些實施方案中，本文所述的基于fc的異二聚體融合體摻入了第一igg1抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽和第二不同igg1抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽，其各自含有選自a330s和p331s的突變。在一些實施方案中，本文所述的基于fc的異二聚體融合體摻入了第一igg1抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽和第二不同igg1抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽，其各自含有突變a330s和p331s。

43、在一些實施方案中，本文所述的基于fc的異二聚體蛋白摻入了igg4或igg1?fc結(jié)構(gòu)域多肽，其被進一步突變以引入鏈間二硫鍵。在一些實施方案中，所述第一igg4或igg1fc結(jié)構(gòu)域多肽包括突變y349c，并且所述第二不同igg4或igg1?fc結(jié)構(gòu)域多肽包括突變s354c。在一些實施方案中，所述第一igg4或igg1?fc結(jié)構(gòu)域多肽包括突變s354c，并且所述第二不同igg4或igg1?fc結(jié)構(gòu)域多肽包括突變y349c。

44、本發(fā)明的一些異二聚體fc融合蛋白包括多亞基蛋白的第一亞基與所述多亞基蛋白的第二不同亞基之間的天然二硫鍵。例如，在一個示例性實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的異二聚體fc融合蛋白包括il-12的p35與p40亞基之間的天然異二聚體二硫鍵。這種蛋白質(zhì)包括p35的c74與p40的c177之間的天然二硫鍵。

45、本發(fā)明的一些異二聚體fc融合蛋白包括多亞基蛋白的第一亞基與所述多亞基蛋白的第二不同亞基之間的人工或工程化的異二聚體二硫鍵。例如，在一個示例性實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的異二聚體fc融合蛋白包括il-12的p35與p40亞基之間的人工或工程化的異二聚體二硫鍵。這種蛋白質(zhì)包括p35的v185c與p40的y292c之間的人工或工程化的二硫鍵。

46、本發(fā)明的一些異二聚體fc融合蛋白包括多亞基蛋白的第一亞基與所述多亞基蛋白的第二不同亞基之間的天然二硫鍵、以及多亞基蛋白的第一亞基與所述多亞基蛋白的第二不同亞基之間的人工或工程化的異二聚體二硫鍵。例如，在一個示例性實施方案中，il-12的p35與p40亞基之間的天然異二聚體二硫鍵，并且包括il-12的p35與p40亞基之間的人工或工程化的異二聚體二硫鍵。這種蛋白質(zhì)包括p35的c74與p40的c177之間的天然二硫鍵、以及p35的v185c與p40的y292c之間的人工或工程化的二硫鍵。

47、本發(fā)明的一些異二聚體fc融合蛋白被工程化以去除天然二硫鍵，然后被非天然的人工或工程化的二硫鍵取代。例如，在一個示例性實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的異二聚體fc融合蛋白包括il-12的其中天然c74被突變?yōu)榻z氨酸的p35、以及il-12的其中天然c177被突變?yōu)榻z氨酸的p40，從而去除il-12的p35與p40亞基之間的天然二硫鍵。向該突變的il-12中引入兩個新的突變，即p35上的v185c和p40上的y292c，從而引入非天然的人工或工程化的二硫鍵。

48、在本發(fā)明的異二聚體fc融合蛋白內(nèi)，第一多肽和第二不同多肽分別包含多亞基細(xì)胞因子的第一亞基和第二不同亞基。在本發(fā)明的異二聚體fc融合蛋白內(nèi)，第一多肽和第二不同多肽分別包含多亞基細(xì)胞因子的第二不同亞基和第一亞基。在一個示例性實施方案中，所述細(xì)胞因子是il-12(例如，人il-12)。還提供了含有本文所述的異二聚體fc融合蛋白中的任一種的配制品、含有表達所述異二聚體fc融合蛋白的一種或多種核酸或表達所述異二聚體fc融合蛋白的一種或多種載體的細(xì)胞、以及使用所述異二聚體fc融合蛋白增強腫瘤細(xì)胞死亡的方法。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了一種配制品，其包括本文所述的異二聚體fc融合蛋白和藥學(xué)上可接受的載體。

49、在另一個方面，本發(fā)明的異二聚體fc融合蛋白還包含至少一個抗體可變結(jié)構(gòu)域(例如，抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域)。在某些實施方案中，所述至少一個抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域與抗體輕鏈可變區(qū)結(jié)合以形成fab，并且所述fab的重鏈可變結(jié)構(gòu)域或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域在所述第一抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽和/或所述第二抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽的n末端融合。

50、在某些實施方案中，本發(fā)明的包含至少一個抗體可變結(jié)構(gòu)域的異二聚體fc融合蛋白具有分別與所述第一抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽和所述第二抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽的c末端連接的多亞基蛋白的第一亞基和所述多亞基蛋白的第二不同亞基。

51、在某些實施方案中，本發(fā)明的包含至少一個抗體可變結(jié)構(gòu)域的異二聚體fc融合蛋白具有分別與所述第二抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽和所述第一抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽的c末端連接的多亞基蛋白的第一亞基和所述多亞基蛋白的第二不同亞基。

52、在某些實施方案中，本發(fā)明的異二聚體fc融合蛋白包含相對于所述第一多肽的第一抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽位于c末端的抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域。在某些實施方案中，本發(fā)明的異二聚體fc融合蛋白包含相對于所述第二多肽的第二抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽c末端定位的抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域。在某些實施方案中，所述抗體重鏈可變區(qū)與抗體輕鏈可變區(qū)結(jié)合以形成scfv。在某些實施方案中，多亞基蛋白的第一亞基和所述多亞基蛋白的第二不同亞基分別與所述第一抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽和所述第二抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽的n末端連接。在某些實施方案中，多亞基蛋白的第一亞基和所述多亞基蛋白的第二不同亞基分別與所述第二抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽和所述第一抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽的n末端連接。

53、在一些實施方案中，本發(fā)明的異二聚體fc融合蛋白不包含抗體可變結(jié)構(gòu)域。例如，在一些實施方案中，所述異二聚體fc融合蛋白由以下組成或基本上由以下組成：多亞基蛋白(例如，il-12蛋白)的第一亞基、任選地包含間隔肽的接頭和第一抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽；以及所述多亞基蛋白(例如，il-12蛋白)的第二不同亞基、任選地包含間隔肽的接頭和第二抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽。

54、在一些實施方案中，本發(fā)明的異二聚體fc融合蛋白還包含蛋白聚糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在一些實施方案中，所述蛋白聚糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合在腫瘤中特異性表達的一種或多種蛋白聚糖。在一些實施方案中，所述蛋白聚糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合選自以下的一種或多種蛋白聚糖：黏結(jié)蛋白聚糖、絲甘蛋白聚糖、cspg4、β蛋白聚糖、磷脂酰肌醇蛋白聚糖、串珠蛋白聚糖、多能蛋白聚糖、短蛋白聚糖和小富亮氨酸蛋白聚糖(slrp)。在一些實施方案中，所述slrp選自飾膠蛋白聚糖、雙糖鏈蛋白聚糖、無孢蛋白、纖調(diào)蛋白聚糖(fibrodulin)和光蛋白聚糖。在一些實施方案中，所述蛋白聚糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域連接至所述第一抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽的c末端。在一些實施方案中，所述蛋白聚糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域連接至所述第二抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽的c末端。

55、在一些實施方案中，本發(fā)明的異二聚體fc融合蛋白還包含膠原蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在一些實施方案中，所述膠原蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合在腫瘤中特異性表達的一種或多種膠原蛋白。在一些實施方案中，所述膠原蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域連接至所述第一抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽的c末端。在一些實施方案中，所述膠原蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域連接至所述第二抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽的c末端。

56、在一些實施方案中，本發(fā)明的異二聚體fc融合蛋白還包含透明質(zhì)酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在一些實施方案中，所述透明質(zhì)酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域連接至所述第一抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽的c末端。在一些實施方案中，所述透明質(zhì)酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域連接至所述第二抗體fc結(jié)構(gòu)域多肽的c末端。

57、本發(fā)明的另一個方面提供了一種治療患者的癌癥的方法。所述方法包括向患者(例如，有需要的患者)施用有效量的本文所述的異二聚體fc融合蛋白或包含有效量的本文所述的多特異性結(jié)合蛋白的配制品。例如，在一些實施方案中，治療癌癥的所述方法包括向患者(例如，需要治療的患者)施用包含有效量的本文所述的異二聚體fc融合蛋白和藥學(xué)上可接受的載體的配制品。

58、在某些實施方案中，本公開文本提供了一種治療癌癥的方法，所述方法包括向患者僅施用單劑量的異二聚體il-12-fc融合蛋白。在某些實施方案中，所述單劑量的量足以誘導(dǎo)對所述癌癥的完全反應(yīng)。在某些實施方案中，所述單劑量的量足以延遲或防止所述癌癥的復(fù)發(fā)。

59、在某些實施方案中，本公開文本提供了一種治療癌癥的方法，所述方法包括向患者僅施用單劑量的異二聚體il-12-fc融合蛋白，所述融合蛋白包含含有seq?id?no:290的氨基酸序列的第一多肽和含有seq?id?no:291的氨基酸序列的第二多肽；或包含所述異二聚體il-12-fc融合蛋白和藥學(xué)上可接受的載體的配制品。在某些實施方案中，包含含有seqid?no:290的氨基酸序列的第一多肽和含有seq?id?no:291的氨基酸序列的第二多肽的異二聚體il-12-fc融合蛋白或包含所述異二聚體il-12-fc融合蛋白和藥學(xué)上可接受的載體的配制品的單劑量的量足以誘導(dǎo)對所述癌癥的完全反應(yīng)。在某些實施方案中，所述單劑量的量足以延遲或防止所述癌癥的復(fù)發(fā)。

60、本發(fā)明的另一個方面提供了一種治療急性放射綜合征的方法，其中所述方法包括向患者施用本文公開的異二聚體fc融合蛋白或配制品。在一些實施方案中，所述急性放射綜合征包括選自以下的一種或多種綜合征：造血放射綜合征、胃腸放射綜合征、神經(jīng)血管放射綜合征和皮膚放射綜合征。在一些實施方案中，所述急性放射綜合征包括選自以下的綜合征：造血放射綜合征、胃腸放射綜合征、神經(jīng)血管放射綜合征和皮膚放射綜合征。

61、總之，本發(fā)明提供了多亞基蛋白的異二聚體fc融合蛋白構(gòu)建體。這些融合蛋白構(gòu)建體可以表現(xiàn)出與原生/天然(native/natural)多亞基蛋白相比更高的血清半衰期、生產(chǎn)期間改進的產(chǎn)量、儲存期間增強的穩(wěn)定性和/或當(dāng)用作治療劑時改進的功效。