本發(fā)明屬于植物病害檢測(cè)，尤其涉及一種基于rpa-lfd技術(shù)快速檢測(cè)蘋果黑星病菌的引物組、試劑盒、方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

0、技術(shù)背景

1、蘋果(malus?domestica?borkh.)是世界上最重要也是最常見(jiàn)的水果之一，在全球水果產(chǎn)量中排名第四。蘋果黑星病是由植物真菌病原菌venturia?inaequalis(cooke)wint.引起的，是影響蘋果生產(chǎn)最具破壞性的病害之一，可造成蘋果果實(shí)價(jià)值損失70％甚至更多。通過(guò)空氣傳播的分生孢子侵染果實(shí)產(chǎn)生典型的“瘡痂”狀病變，嚴(yán)重破壞蘋果果實(shí)外觀，失去商品價(jià)值。

2、據(jù)估計(jì)，僅美國(guó)東部的蘋果生產(chǎn)商每年就花費(fèi)超過(guò)1860萬(wàn)美元用于控制該病害。v.inaequalis是我國(guó)對(duì)外檢疫對(duì)象，可以通過(guò)子囊殼的形式在落葉或蘋果果實(shí)上越冬，以菌絲體、分生孢子在芽鱗內(nèi)或樹(shù)枝潰瘍部越冬，初侵染來(lái)源較廣，在果樹(shù)發(fā)芽期、花蕾開(kāi)放期、花瓣脫落期等生長(zhǎng)關(guān)鍵期均可發(fā)生侵染，傳播快而且防治困難。因此，快速檢測(cè)蘋果黑星病菌對(duì)于病害的防治具有重要作用。

3、對(duì)于蘋果黑星病菌的鑒定，傳統(tǒng)方法需要使用單孢分離或者組織分離方法對(duì)該病原菌進(jìn)行分離純化，隨后通過(guò)形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)對(duì)其進(jìn)行鑒定。然而該病菌生長(zhǎng)極其緩慢而且容易受到其它菌的干擾，不容易分離獲得，因此采用傳統(tǒng)分離鑒定方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力。針對(duì)蘋果黑星病菌，目前已經(jīng)開(kāi)發(fā)了普通pcr、real-time?pcr、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法。普通的pcr方法檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，real-time?pcr方法成本高而且需要高昂設(shè)備；環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(lamp)需要專屬的升溫設(shè)備，現(xiàn)有檢測(cè)方法不能滿足田間高效檢測(cè)需求。

4、重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)(recombinase?polymerase?amplification,rpa)是近年來(lái)新興的核酸擴(kuò)增技術(shù)，反應(yīng)過(guò)程受環(huán)境限制小，操作方便，對(duì)檢測(cè)者較為友好；側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l(lfd)的視覺(jué)檢測(cè)方法只需10分鐘即可完成，不需要其他顯色設(shè)備，與rpa相結(jié)合簡(jiǎn)化了檢測(cè)程序，該方法符合對(duì)病菌進(jìn)行快速檢測(cè)的條件，不需要復(fù)雜的熱循環(huán)器，適合現(xiàn)場(chǎng)試驗(yàn)。

5、中國(guó)發(fā)明cn202311516904.5說(shuō)明書中記載了一種檢測(cè)蘋果黑星病菌的引物、試劑盒及其檢測(cè)方法，檢測(cè)蘋果黑星病菌的rpa引物及crispr/cas12a引物；檢測(cè)蘋果黑星病菌的試劑盒，包含上述引物、cas12蛋白、t7轉(zhuǎn)錄酶、dna聚合酶以及cas12/13專用核酸檢測(cè)試紙條。檢測(cè)方法包括：利用rpa擴(kuò)增產(chǎn)物、體外轉(zhuǎn)錄合成的指導(dǎo)rna和fb探針建立crispr/cas12a檢測(cè)反應(yīng)體系；反應(yīng)結(jié)束后將cas12/13專用核酸檢測(cè)試紙條插入到反應(yīng)管中，觀察試紙條上檢測(cè)線的變化；若在試紙條的測(cè)試條帶上出現(xiàn)顏色變化，即為陽(yáng)性反應(yīng)，證明含有蘋果黑星病菌。本發(fā)明特異性強(qiáng)、靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確且實(shí)用性高。

6、上述專利方法在特異性方面，沒(méi)有測(cè)試是否能區(qū)分蘋果黑星病菌(venturiainaequalis)同屬不同種的近似種群梨黑星病菌(v.nashicola)、蘋果痣狀瘡痂病菌(v.asperata)以及在口岸檢疫和田間檢測(cè)中經(jīng)常發(fā)生在果實(shí)上的褐腐病菌、灰霉病菌等，因此不能確定該方法是否對(duì)蘋果黑星病菌具有特異性。在檢測(cè)靈敏度方面，上述專利方法中設(shè)置了從1pg到0.01fg的檢測(cè)濃度,檢測(cè)結(jié)果顯示除了空白對(duì)照，所有測(cè)試的濃度都能呈現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，而且檢測(cè)強(qiáng)度差異不明顯，因此無(wú)法判斷該方法真正的檢測(cè)靈敏度是多少。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了解決以上技術(shù)存在的問(wèn)題，本發(fā)明提供一種基于rpa-lfd技術(shù)快速檢測(cè)蘋果黑星病菌的引物組、試劑盒、方法及應(yīng)用，基于rpa-lfd技術(shù)，建立快速檢測(cè)蘋果黑星病菌的新方法，進(jìn)行檢疫性植物病原物的鑒定及田間植物病害的快速檢測(cè)；本發(fā)明采用rpa-lfd法檢測(cè)蘋果黑星病菌，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、簡(jiǎn)便快速、不依賴于大型儀器設(shè)備等特點(diǎn)，可用于田間實(shí)際樣品檢測(cè)。

2、解決以上技術(shù)問(wèn)題的一種基于rpa-lfd技術(shù)快速檢測(cè)蘋果黑星病菌(v.inaequalis)的引物組，pcr擴(kuò)增引物，其正向引物序列如seq?id?no.1所示，反向引物序列如seq?id?no.2所示。

3、具體的：正向引物v.in-lfd-f1：5′-catttattcactttgttatcaccctcactg-3′；(seqid?no.1)；

4、反向引物v.in-lfd-r1：ctattgtaatcgttagcgtcgtcatagt-3′；(seq?id?no.2)。

5、所述的引物在檢測(cè)蘋果黑星病菌中的應(yīng)用。

6、所述的引物在制備蘋果黑星病菌的檢測(cè)試劑或試劑盒中的應(yīng)用。

7、本發(fā)明還提供了一種基于rpa-lfd技術(shù)檢測(cè)蘋果黑星病菌的試劑盒，至少包括1次用量以上的權(quán)利要求1所述的引物及探針組合，所述引物和探針組合，其正向引物序列如seq?id?no.1所示，反向引物序列如seq?id?no.2所示，其中反向引物序列5′端用生物素(biotin)標(biāo)記后的引物序列如seq?id?no.3所示；探針序列如seq?id?no.4所示，5′端進(jìn)行fam抗原基團(tuán)修飾，距離5′端第31個(gè)堿基的位置處用四氫呋喃(thf)作為dspacer替代一個(gè)堿基，3′末端標(biāo)記一個(gè)c3-spacer修飾基團(tuán)做阻斷。

8、具體的：修飾后的反向引物v.in-lfd-r1b：

9、5′-biotin-ctattgtaatcgttagcgtcgtcatagt-3′；(seq?id?no.3)；

10、探針序列v.in-lfd-probe1：

11、5′-fam-cgctattcacgtaccgccactcaaggcagc(thf)caactttctccggtcc3-spacer-3′；(seq?id?no.4)。

12、所述試劑盒還包括：裝有凍干粉的反應(yīng)管、a?buffer、b?buffer、去離子水、lfd側(cè)流層析試紙條。

13、所述檢測(cè)蘋果黑星病菌的試劑盒在檢測(cè)蘋果黑星病菌中的應(yīng)用。

14、本技術(shù)還提供了一種基于rpa-lfd技術(shù)檢測(cè)蘋果黑星病菌的方法，包括以下步驟：

15、(1)提取待測(cè)樣本dna；

16、(2)以dna為模板，利用所述引物和探針組合或所述蘋果黑星病菌檢測(cè)的試劑盒進(jìn)行rpa擴(kuò)增；應(yīng)用側(cè)流層析試紙條進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)；當(dāng)試紙條出現(xiàn)兩條帶(control?lineand?test?line)，一條位于質(zhì)控區(qū)內(nèi)，一條位于檢測(cè)區(qū)，則結(jié)果為陽(yáng)性，表明樣本中含有蘋果黑星病菌；當(dāng)試紙條只有質(zhì)控區(qū)出現(xiàn)一條帶(control?line)，檢測(cè)區(qū)沒(méi)有條帶，則結(jié)果是陰性，表明樣本中不含有蘋果黑星病菌。

17、本發(fā)明先針對(duì)蘋果黑星病菌的ef基因作為靶標(biāo)序列，采用primer?3plus軟件設(shè)計(jì)了一系列的rpa引物，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)對(duì)所設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行篩選，獲得了一對(duì)用于rpa檢測(cè)蘋果黑星病菌的專用引物和探針。

18、本發(fā)明中有益效果如下：

19、a、本發(fā)明所使用的引物探針擴(kuò)增效果好，特異性強(qiáng)，靈敏度高，通過(guò)在檢測(cè)區(qū)形成引物-探針異二聚體，使試紙條呈現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，本發(fā)明所建立檢測(cè)方法可檢測(cè)6.116×10-6ng/μl的蘋果黑星病菌基因組dna。

20、b、本發(fā)明的rpa技術(shù)并結(jié)合側(cè)流層析技術(shù)檢測(cè)蘋果黑星病菌的方法，兼具分子生物學(xué)檢測(cè)的高靈敏度及免疫學(xué)檢測(cè)的高特異性，且操作簡(jiǎn)便，不需復(fù)雜儀器，適于基層實(shí)驗(yàn)室和檢疫現(xiàn)場(chǎng)的蘋果黑星病菌快速篩查檢測(cè)。

21、c、本發(fā)明的方法與常規(guī)pcr相比，檢測(cè)速度快，全程無(wú)需改變反應(yīng)溫度，無(wú)需變性，擺脫了對(duì)熱循環(huán)儀器的依賴，在41℃下反應(yīng)9min左右即可完成擴(kuò)增。不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備，適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

22、d、本發(fā)明可以用于帶菌植株組織中蘋果黑星病菌的快速檢測(cè)，只需約12min即可完成檢測(cè)，是一種檢測(cè)蘋果黑星病菌的有效手段。本發(fā)明檢測(cè)方法還可用于蘋果黑星病菌的發(fā)病前期檢測(cè)，對(duì)于病害的預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)、確定防治適期、有效防治病害具有十分重要的意義。

23、本發(fā)明系采用rpa-lfd技術(shù)建立快速檢測(cè)蘋果黑星病菌的方法，特異性強(qiáng)、靈敏度高，可用于實(shí)際樣品的檢測(cè)，為蘋果黑星病菌的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)提供一種靈敏、可靠和便捷的新方法。