本發(fā)明屬于生物，具體涉及蛋白質(zhì)tabhlh92在調(diào)控小麥分蘗中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、禾谷類農(nóng)作物的產(chǎn)量由有效穗數(shù)、穗粒數(shù)和千粒重所決定。禾谷類農(nóng)作物分蘗數(shù)量很大程度上決定了有效穗數(shù)的多少，也與農(nóng)作物適應(yīng)不同環(huán)境條件(如土壤中氮素的豐缺)的能力有關(guān)。分蘗對于增加葉面積、光截獲量和光合作用至關(guān)重要，這反過來又會影響籽粒數(shù)、籽粒灌漿和產(chǎn)量。因此，分蘗能力是小麥和水稻育種過程中被選擇的重要性狀。

2、分蘗性狀由復(fù)雜且相互關(guān)聯(lián)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)，這些調(diào)控網(wǎng)絡(luò)涉及氮(n)、碳和植物激素等信號傳導(dǎo)。如獨腳金內(nèi)酯(sls)或sl衍生代謝物是分蘗芽生長的內(nèi)源性抑制劑，可通過誘導(dǎo)teosinte?branched?1(tb1)基因的表達抑制分蘗芽生長。sl生物合成和信號傳導(dǎo)對于控制小麥分蘗至關(guān)重要。在小麥中敲低sl合成通路基因tad27的表達可導(dǎo)致sl缺乏和分蘗數(shù)增加，而過表達tad27則具有相反的表型。squamosa-promoter?binding?protein-like(spl)家族成員也被證明參與sl信號傳導(dǎo)，從而參與對水稻分蘗的調(diào)控。在小麥中，一些spl基因也被發(fā)現(xiàn)參與sl信號傳導(dǎo)，進而影響小麥分蘗。在小麥中過表達tae-mir156可抑制taspl3/17等spl基因的表達，導(dǎo)致分蘗數(shù)量增加和小穗發(fā)育缺陷。taspl3/17與sl信號通路關(guān)鍵因子tad53互作，這種相互作用抑制了taspl3/17對tatb1基因的轉(zhuǎn)錄激活，tatb1此前已被證明可以抑制小麥的分蘗芽生長。最近，taspl3/17被發(fā)現(xiàn)與phytochrome-interacting?factor-like(pil)基因tapil1存在相互作用，而tapil1可通過轉(zhuǎn)錄激活tatb1表達抑制小麥分蘗的生長。此外，參與生長素、細胞分裂素和脫落酸(aba)生物合成和信號傳導(dǎo)的一些基因也被發(fā)現(xiàn)可以控制小麥分蘗，包括脫乙?；富騮ahst1l，生長素生物合成基因tryptophan?aminotransferase-related?tatar2.1-3a，生長素轉(zhuǎn)運體基因tapin1，terminal?flower?1基因tatfl1-5，spl轉(zhuǎn)錄因子taspl8，和ankyrin-repeatprotein編碼基因tiller?number1(tatn1)。

3、氮素和蔗糖等營養(yǎng)物質(zhì)與一些激素信號存在互作，影響分蘗的生長。蔗糖在植物體內(nèi)的遷移性及其在分蘗芽中的積累水平對于促進分蘗芽的生長至關(guān)重要。蔗糖在促進分蘗芽生長的過程中，與細胞分裂素存在協(xié)同作用，但與sl存在拮抗作用。如蔗糖可促進d53蛋白積累，進而促進水稻分蘗。蔗糖對于促進小麥分蘗也至關(guān)重要。如定位于1a染色體上的分蘗抑制位點tin1降低了分蘗芽中蔗糖含量，從而降低小麥的分蘗數(shù)。在小麥中過表達tacml20基因增加了地上部中水溶態(tài)糖含量，也增加了小麥的分蘗數(shù)。

4、氮素是植物生長發(fā)育必需的礦質(zhì)營養(yǎng)元素，施用氮肥可以增加小麥分蘗和穗數(shù)，從而增加小麥產(chǎn)量。在小麥中，調(diào)控氮素吸收和利用的轉(zhuǎn)錄因子tanac2、tanfya-b1和tabzip60影響小麥分蘗數(shù)和穗數(shù)；參與氮素吸收和同化的基因tanrt2.5、tags2和tanadh-gogat也影響小麥的分蘗數(shù)和穗數(shù)。但轉(zhuǎn)錄因子tabhlh92調(diào)控小麥分蘗數(shù)還未見報道。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何提高小麥的分蘗數(shù)，以提高小麥產(chǎn)量。

2、為了解決現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明提供了蛋白質(zhì)或調(diào)控基因的表達物質(zhì)或調(diào)控所述蛋白質(zhì)活性或含量的物質(zhì)在調(diào)控植物分蘗能力中的應(yīng)用。

3、本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)或調(diào)控基因的表達物質(zhì)或調(diào)控所述蛋白質(zhì)活性或含量的物質(zhì)在下述任一種中的應(yīng)用：

4、1)在調(diào)控植物分蘗能力中的應(yīng)用；

5、2)在制備調(diào)控植物分蘗能力的產(chǎn)品中的應(yīng)用；

6、3)在培育分蘗能力改變的植物中的應(yīng)用；

7、4)在制備培育分蘗能力改變的植物的產(chǎn)品中的應(yīng)用；

8、5)在植物育種中的應(yīng)用；

9、所述蛋白質(zhì)為如下任一所示蛋白質(zhì)：

10、a1)氨基酸序列為seq?id?no:2的蛋白質(zhì)；

11、a2)氨基酸序列為seq?id?no:4的蛋白質(zhì)；

12、a3)氨基酸序列為seq?id?no:6的蛋白質(zhì)；

13、a4)將a1)-a3)中任一所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白質(zhì)；

14、a5)與a1)-a4)中任一所限定的氨基酸序列具有75％以上同一性且具有相同功能的蛋白質(zhì)；

15、a6)在a1)-a3)中任一所限定的蛋白質(zhì)的末端連接標簽后得到的融合蛋白。

16、上述a1)所述蛋白質(zhì)的名稱為tabhlh92。

17、為了使a1)中的蛋白質(zhì)便于純化或檢測，可在由序列表中seq?id?no:2、seq?idno:4或seq?id?no:6所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接標簽蛋白。

18、上述蛋白質(zhì)可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。

19、所述標簽蛋白包括但不限于：gst(谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶)標簽蛋白、his6標簽蛋白(his-tag)、mbp(麥芽糖結(jié)合蛋白)標簽蛋白、flag標簽蛋白、sumo標簽蛋白、ha標簽蛋白、myc標簽蛋白、egfp(增強型綠色熒光蛋白)、ecfp(增強型青色熒光蛋白)、eyfp(增強型黃綠色熒光蛋白)、mcherry(單體紅色熒光蛋白)或avitag標簽蛋白。

20、本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以很容易地采用已知的方法，例如定向進化或點突變的方法，對本發(fā)明的編碼蛋白質(zhì)tabhlh92的核苷酸序列進行突變。那些經(jīng)過人工修飾的，具有與本發(fā)明分離得到的蛋白質(zhì)tabhlh92的核苷酸序列75％或75％以上同一性的核苷酸，只要編碼蛋白質(zhì)tabhlh92且具有蛋白質(zhì)tabhlh92功能，均是衍生于本發(fā)明的核苷酸序列并且等同于本發(fā)明的序列。

21、上述75％或75％以上同一性，可為80％、85％、90％或95％以上的同一性。

22、本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性?？墒褂脟H互聯(lián)網(wǎng)上的同源性檢索站點測定氨基酸序列的同一性，如ncbi主頁網(wǎng)站的blast網(wǎng)頁。例如，可在高級blast2.1中，通過使用blastp作為程序，將expect值設(shè)置為10，將所有filter設(shè)置為off，使用blosum62作為matrix，將gap?existence?cost，per?residue?gap?cost和lambda?ratio分別設(shè)置為11，1和0.85(缺省值)并進行檢索一對氨基酸序列的同一性進行計算，然后即可獲得同一性的值(％)。

23、本文中，所述80％以上的同一性可為至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

24、本文中，所述90％以上的同一性可為至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

25、上述應(yīng)用中，所述蛋白質(zhì)來源于小麥(triticum?aestivum?l.)。

26、本文中，調(diào)控所述蛋白質(zhì)活性和/或含量的物質(zhì)可為調(diào)控基因表達的物質(zhì)，所述基因編碼所述蛋白質(zhì)tabhlh92。

27、上文中，所述調(diào)控基因表達的物質(zhì)可為進行如下6種調(diào)控中至少一種調(diào)控的物質(zhì)：1)在所述基因轉(zhuǎn)錄水平上進行的調(diào)控；2)在所述基因轉(zhuǎn)錄后進行的調(diào)控(也就是對所述基因的初級轉(zhuǎn)錄物的剪接或加工進行的調(diào)控)；3)對所述基因的rna轉(zhuǎn)運進行的調(diào)控(也就是對所述基因的mrna由細胞核向細胞質(zhì)轉(zhuǎn)運進行的調(diào)控)；4)對所述基因的翻譯進行的調(diào)控；5)對所述基因的mrna降解進行的調(diào)控；6)對所述基因的翻譯后的調(diào)控(也就是對所述基因翻譯的蛋白質(zhì)的活性進行調(diào)控)。

28、本發(fā)明中，所述調(diào)控可為上調(diào)或增強或提高。所述調(diào)控也可為下調(diào)或減弱或降低。

29、本文中，所述增強、提高或上調(diào)受體植物中前文所述蛋白質(zhì)的編碼基因的表達量，或/和增強、提高或上調(diào)上述蛋白質(zhì)的編碼基因的活性和/或含量是通過將上述蛋白質(zhì)的編碼基因?qū)胨鍪荏w植物實現(xiàn)的。

30、本文中，所述調(diào)控所述蛋白質(zhì)的編碼基因的表達可為抑制或降低或下調(diào)所述編碼基因表達。抑制或降低或下調(diào)所述編碼基因表達可通過基因敲除或基因沉默實現(xiàn)。

31、本文中，所述基因敲除(gene?knock-out)是指通過基因編輯技術(shù)使特定靶基因失活的現(xiàn)象?；蚯贸ㄟ^dna序列的改變使特定靶基因失活，包括且不限于基于鋅指核酸酶(zinc-finger?nucleases,zfn)，轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)因子核酸酶(transcriptionactivator-like?effector?nucleases,talen)和crispr/cas系統(tǒng)，crispr(clusteredregulatory?interspaced?short?palindromic?repeat)即成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列，是基因組中一個含有多個短重復(fù)序列的位點，cas9蛋白在rna的介導(dǎo)下能夠?qū)rrna–tracrrna識別的靶序列進行切割。

32、本文中，所述基因沉默是指在不損傷原有dna的情況下使基因不表達或低表達的現(xiàn)象。基因沉默以不改變dna序列為前提，使基因不表達或低表達?；虺聊砂l(fā)生在兩種水平上，一種是由于dna甲基化、異染色質(zhì)化以及位置效應(yīng)等引起的轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默，另一種是轉(zhuǎn)錄后基因沉默，即在基因轉(zhuǎn)錄后的水平上通過對靶標rna進行特異性抑制而使基因失活，包括反義rna、共抑制(co-suppression)、基因壓抑(quelling)、rna干擾(rnai)和微小rna(mirna)介導(dǎo)的翻譯抑制等。

33、上述應(yīng)用中，所述調(diào)控基因的表達物質(zhì)或調(diào)控所述蛋白質(zhì)活性或含量的物質(zhì)可為與前文所述蛋白質(zhì)相關(guān)的生物材料，所述生物材料可為下述任一種：

34、c1)編碼前文所述蛋白的核酸分子；

35、c2)含有c1)所述核酸分子的表達盒；

36、c3)含有c1)所述核酸分子的重組載體、或含有c2)所述表達盒的重組載體；

37、c4)含有c1)所述核酸分子的重組微生物、或含有c2)所述表達盒的重組微生物、或含有c3)所述重組載體的重組微生物；

38、c5)含有c1)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物細胞系、或含有c2)所述表達盒的轉(zhuǎn)基因植物細胞系；

39、c6)含有c1)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物組織、或含有c2)所述表達盒的轉(zhuǎn)基因植物組織；

40、c7)含有c1)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物器官、或含有c2)所述表達盒的轉(zhuǎn)基因植物器官；

41、e1)抑制或降低或沉默前文所述蛋白編碼基因表達的核酸分子；

42、e2)含有e1)所述核酸分子的表達盒；

43、e3)含有e1)所述核酸分子的重組載體、或含有e2)所述表達盒的重組載體；

44、e4)含有e1)所述核酸分子的重組微生物、或含有e2)所述表達盒的重組微生物、或含有e3)所述重組載體的重組微生物；

45、e5)含有e1)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物細胞系、或含有e2)所述表達盒的轉(zhuǎn)基因植物細胞系；

46、e6)含有e1)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物組織、或含有e2)所述表達盒的轉(zhuǎn)基因植物組織；

47、e7)含有e1)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物器官、或含有e2)所述表達盒的轉(zhuǎn)基因植物器官。

48、上述應(yīng)用中，c1)所述核酸分子可為如下任一所示的dna分子，

49、d1)編碼區(qū)序列是序列表中seq?id?no:1所示的dna分子；

50、d2)編碼區(qū)序列是序列表中seq?id?no:3所示的dna分子；

51、d3)編碼區(qū)序列是序列表中seq?id?no:5所示的dna分子；

52、d4)與d1)-d3)任一限定的核苷酸序列具有90％或90％以上同一性，且編碼權(quán)利要求1中所述蛋白的dna分子；

53、d5)在嚴格條件下與d1)-d3)任一限定的核苷酸序列雜交，且編碼前文所述蛋白的dna分子。

54、本文所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因組dna或重組dna；所述核酸分子也可以是rna，如grna、mrna、sirna、shrna、sgrna、mirna或反義rna。

55、本文所述載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，包括但不限于：質(zhì)粒、噬菌體(如λ噬菌體或m13絲狀噬菌體等)、黏粒(即柯斯質(zhì)粒)、ti質(zhì)?；虿《据d體。具體可為載體lgy-oe3。

56、可用現(xiàn)有的植物表達載體構(gòu)建含有tabhlh92基因的重組表達載體。所述植物表達載體包括但不限于如雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。所述植物表達載體還可包含外源基因的3′端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號和任何其它參與mrna加工或基因表達的dna片段。所述聚腺苷酸信號可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mrna前體的3′端，如包括但不限于農(nóng)桿菌冠癭瘤誘導(dǎo)(ti)質(zhì)粒基因(如胭脂合成酶nos基因)、植物基因(如大豆貯藏蛋白基因)3′端轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)均具有類似功能。

57、使用tabhlh92基因構(gòu)建重組植物表達載體時，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強型啟動子或組成型啟動子，包括但不限于如花椰菜花葉病毒(camv)35s啟動子、玉米的泛素啟動子(ubiquitin)，它們可單獨使用或與其它植物啟動子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉(zhuǎn)錄增強子，這些增強子區(qū)域可以是atg起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。

58、為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所用植物表達載體進行加工，如加入包括但不限于可在植物中表達的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(gus基因、熒光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標記物(慶大霉素標記物、卡那霉素標記物等)或是抗化學試劑標記基因(如抗除草劑基因)等。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。

59、利用任何一種可以引導(dǎo)外源基因在植物中表達的載體，將本發(fā)明所提供的tabhlh92基因或基因的片段導(dǎo)入植物細胞或受體植物，可獲得分蘗能力改變的轉(zhuǎn)基因細胞系及轉(zhuǎn)基因植株。攜帶tabhlh92基因的表達載體可通過使用ti質(zhì)粒、ri質(zhì)粒、植物病毒載體，直接dna轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學方法轉(zhuǎn)化植物細胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成植株。

60、可選地，e2)所述的表達盒為攜有seq?id?no:7所示dna分子的表達盒。

61、本發(fā)明還提供了一種提高植物分蘗能力的方法，所述方法包括步驟m，所述步驟m為抑制或降低或沉默目的植物中前文所述蛋白的活性和/或含量，或/和，抑制或降低或沉默前文所述蛋白的編碼基因的表達量，來提高植物分蘗能力。

62、本發(fā)明還提供了一種降低植物分蘗能力的方法，所述方法包括步驟p，所述步驟p為增強、提高或上調(diào)目的植物中前文所述蛋白的活性和/或含量，或/和，增強、提高或上調(diào)前文所述蛋白的編碼基因的表達量，來降低植物分蘗能力。

63、上述方法中，所述降低目的植物中所述蛋白質(zhì)tabhlh92的編碼基因的表達量和/或活性可為利用基因突變、基因敲除、基因編輯或基因敲減技術(shù)使目的植物基因組中所述蛋白質(zhì)tabhlh92的編碼基因活性下降或失活。

64、本發(fā)明提供一種培育分蘗能力提高的植物的方法，包括抑制或降低或沉默目的植物中上述蛋白的編碼基因的表達和/或上述蛋白的含量和/或活性，或/和抑制或降低或沉默上述蛋白質(zhì)的編碼基因的活性和/或含量，得到分蘗能力提高的植物。

65、在本發(fā)明的一個實施方案中，所述培育分蘗能力提高植物的育種方法包括如下步驟：

66、(1)構(gòu)建抑制或降低或沉默前文所述蛋白質(zhì)的編碼基因的重組表達載體；

67、(2)將步驟(1)構(gòu)建的重組表達載體轉(zhuǎn)入受體植物中，獲得分蘗能力高于所述受體植物的植物。

68、本發(fā)明中，所述調(diào)控蛋白質(zhì)tabhlh92表達具體可為小麥苗期地上部和根系中tabhlh92表達。

69、本發(fā)明中，所述植物育種的目的可包括培育分蘗能力提高的植物。

70、本發(fā)明中，所述分蘗能力體現(xiàn)在分蘗芽的生長或/和分蘗數(shù)。

71、本發(fā)明中，所述分蘗能力還包括在高氮或/和低氮培養(yǎng)條件下的分蘗能力。

72、所述高氮條件為2mm?n，所述低氮條件為0.2mm?n。

73、本發(fā)明中，所述植物可為如下任一種：

74、n1)雙子葉植物：

75、n2)禾本目植物；

76、n3)禾本科植物；

77、n4)小麥屬植物；

78、n5)小麥。

79、本發(fā)明中，所述小麥可為小麥品種科農(nóng)199。

80、本發(fā)明通過降低tabhlh92來調(diào)控小麥的分蘗能力，小麥根系和地上部中tabhlh92的表達受到高供氮水平的抑制。tabhlh92可負調(diào)控不同供氮水平下的小麥分蘗數(shù)，通過rnai方法降低tabhlh92表達量可以顯著增加不同供氮水平下的分蘗數(shù)，從而為提高不同供氮水平下小麥產(chǎn)量奠定基礎(chǔ)，達到節(jié)肥增產(chǎn)和保護環(huán)境的目標。