本發(fā)明屬于生物化工、合成生物學(xué)和基因工程及代謝工程領(lǐng)域，具體涉及一種透明質(zhì)酸重組菌的構(gòu)建及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、透明質(zhì)酸(hyaluronic?acid，簡稱ha)，是一種直鏈高分子多糖，由單體n-乙酰氨基葡萄糖和d-葡萄糖醛酸連接而成，分子量能夠達(dá)到104～107da，廣泛應(yīng)用于化妝品、食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域。ha的生物活性和使用效果由其相對分子量(mw)直接決定，不同分子量的透明質(zhì)酸具有不同的用途，分子量介于104～106da的低分子量透明質(zhì)酸主要添加于護(hù)膚品和化妝品中，能夠起到良好的保濕功效，還能夠增加皮膚彈性、減少皺紋；分子量低于104da的透明質(zhì)酸低聚寡糖可以添加于口服保健品中，能夠起到增加細(xì)胞新陳代謝、預(yù)防衰老的作用。

2、生物發(fā)酵法已經(jīng)成為我國透明質(zhì)酸生產(chǎn)的主要工藝，工業(yè)生產(chǎn)中的常用菌株為獸疫鏈球菌等動物性致病菌，產(chǎn)量為6-12g/l。利用獸疫鏈球菌生產(chǎn)透明質(zhì)酸也具有一定的局限性：首先，獸疫鏈球菌是動物致病菌，具有致病性風(fēng)險；其次，鏈球菌代謝背景不夠清晰，利用分子手段改造較為困難；最后，獸疫鏈球菌生物發(fā)酵產(chǎn)生的透明質(zhì)酸分子量較高，不適用于直接添加到化妝品或保健品中。因此，開發(fā)更加經(jīng)濟(jì)、安全且分子量低的生產(chǎn)透明質(zhì)酸基因工程菌株具有重要的意義。

3、構(gòu)建生產(chǎn)透明質(zhì)酸的基因工程菌株需要引入透明質(zhì)酸合成酶，迄今為止，透明質(zhì)酸已經(jīng)在大腸桿菌、乳酸菌、枯草芽孢桿菌、谷氨酸棒桿菌等多種微生物中實現(xiàn)了異源合成。但目前，低分子量透明質(zhì)酸的基因工程菌株生物發(fā)酵生產(chǎn)產(chǎn)量較低、發(fā)酵工藝較為繁瑣。因此，構(gòu)建一株高產(chǎn)低分子量透明質(zhì)酸的基因工程菌株成為本領(lǐng)域迫切需要解決的一個技術(shù)問題。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種透明質(zhì)酸重組菌的構(gòu)建及其應(yīng)用。

2、本發(fā)明構(gòu)建的重組谷氨酸棒桿菌，在食品安全級微生物谷氨酸棒桿菌中構(gòu)建表達(dá)低分子量透明質(zhì)酸的合成途徑，實現(xiàn)從葡萄糖一步生產(chǎn)透明質(zhì)酸的基礎(chǔ)上，調(diào)控前體物質(zhì)積累，弱化競爭途徑，提高了低分子量透明質(zhì)酸的產(chǎn)量。

3、本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

4、一種重組谷氨酸棒桿菌，含有透明質(zhì)酸合酶基因hasa、udp-葡萄糖脫氫酶基因udga2、谷氨酰胺-6-磷酸果糖轉(zhuǎn)氨酶基因glms，宿主菌為谷氨酸棒桿菌；

5、透明質(zhì)酸合酶基因hasa的核苷酸序列如seq?id?no.1所示；

6、udp-葡萄糖脫氫酶基因udga2的核苷酸序列如seq?id?no.2所示；

7、谷氨酰胺-6-磷酸果糖轉(zhuǎn)氨酶基因glms的核苷酸序列如seq?id?no.3所示。

8、根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，宿主菌為谷氨酸棒桿菌atcc13032。

9、根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述重組谷氨酸棒桿菌中的質(zhì)粒載體為pec-xk99e和/或pxmj19。

10、根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述重組谷氨酸棒桿菌中，透明質(zhì)酸合酶基因hasa、udp-葡萄糖脫氫酶基因udga2、谷氨酰胺-6-磷酸果糖轉(zhuǎn)氨酶基因glms連接到質(zhì)粒pec-xk99e中，為重組質(zhì)粒pec-xk99e-hasa-udga2-glms；

11、所述透明質(zhì)酸合酶基因hasa、udp-葡萄糖脫氫酶基因udga2、谷氨酰胺-6-磷酸果糖轉(zhuǎn)氨酶基因glms分別連接有序列rbs1、rbs2、rbs3；

12、rbs1的核苷酸序列如seq?id?no.11所示、rbs2的核苷酸序列如seq?id?no.12所示、rbs3的核苷酸序列如seq?id?no.13所示。

13、根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述重組谷氨酸棒桿菌中，還含有dcas9蛋白基因dcas9，以及基因sgrna1、sgrna2、sgrna3、sgrna4、sgrna5、sgrna6中的任一種；

14、dcas9蛋白基因dcas9的核苷酸序列如seq?id?no.4所示；

15、sgrna1的核苷酸序列如seq?id?no.5所示；

16、sgrna2的核苷酸序列如seq?id?no.6所示；

17、sgrna3的核苷酸序列如seq?id?no.7所示；

18、sgrna4的核苷酸序列如seq?id?no.8所示；

19、sgrna5的核苷酸序列如seq?id?no.9所示；

20、sgrna6的核苷酸序列如seq?id?no.10所示。

21、進(jìn)一步優(yōu)選的，dcas9蛋白基因dcas9與sgrna1、sgrna2、sgrna3、sgrna4、sgrna5、sgrna6中的任一種連接到質(zhì)粒pxmj19中，分別為重組質(zhì)粒pxmj19-dcas9-ostasgrna1、pxmj19-dcas9-ostasgrna2、pxmj19-dcas9-ostasgrna3、pxmj19-dcas9-treysgrna4、pxmj19-dcas9-treysgrna5或pxmj19-dcas9-treysgrna6。

22、更優(yōu)選的，所述重組谷氨酸棒桿菌中，dcas9蛋白基因dcas9與sgrna1連接到質(zhì)粒pxmj19中，為重組質(zhì)粒pxmj19-dcas9-ostasgrna1。

23、一株谷氨酸棒桿菌(corynebacterium?glutamicum)ha-z01，2024年11月26日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為中國.武漢.武漢大學(xué)，保藏編號為cctcc?no：m20242640。

24、上述重組谷氨酸棒桿菌的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

25、(1)基于谷氨酸棒桿菌的密碼子偏好性，設(shè)計得到透明質(zhì)酸合酶的基因序列hasa，如seq?id?no.1所示；設(shè)計上游引物hasa-f?seq?id?no.14和下游引物hasa-r?seq?idno.15，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，擴(kuò)增獲得rbs1-hasa基因；

26、(2)將質(zhì)粒pec-xk99e分別進(jìn)行ecorⅰ與sacⅰ雙酶切，制得線性化質(zhì)粒，將線性化質(zhì)粒與步驟(1)得到的rbs1-hasa基因通過無縫克隆進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化宿主菌e.colijm109感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行篩選并提取質(zhì)粒，得到重組質(zhì)粒pec-xk99e-hasa；

27、(3)以udga2-f?seq?id?no.16和udga2-r?seq?id?no.17為上下游引物，以谷氨酸棒桿菌atcc13869基因組dna為模板或者seq?id?no.2為模板，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，獲得udp-葡萄糖脫氫酶rbs2-udga2基因序列；

28、(4)將步驟(2)得到的重組質(zhì)粒pec-xk99e-hasa，分別進(jìn)行sacⅰ與kpnⅰ雙酶切，制得線性化質(zhì)粒，將線性化質(zhì)粒與步驟(3)得到的rbs2-udga2基因通過無縫克隆進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化宿主菌e.coli?jm109感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行篩選并提取質(zhì)粒，得到重組質(zhì)粒pec-xk99e-hasa-udga2；

29、(5)基于谷氨酸棒桿菌的密碼子偏好性，設(shè)計得到谷氨酰胺-6-磷酸果糖轉(zhuǎn)氨酶的基因序列g(shù)lms，如seq?id?no.3所示；以glms-f?seq?id?no.18和glms-rseq?id?no.19為上下游引物，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，獲得rbs3-glms基因；

30、(6)將步驟(4)得到的重組質(zhì)粒pec-xk99e-hasa-udga2，分別進(jìn)行kpnⅰ與bamhⅰ雙酶切，制得線性化質(zhì)粒，將線性化質(zhì)粒與步驟(5)得到的rbs3-glms基因通過無縫克隆進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化宿主菌e.coli?jm109感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行篩選并提取質(zhì)粒進(jìn)行pcr及測序驗證，得到重組質(zhì)粒pec-xk99e-hasa-udga2-glms；

31、(7)將步驟(6)得到的重組質(zhì)粒pec-xk99e-hasa-udga2-glms轉(zhuǎn)化谷氨酸棒桿菌atcc13032中，篩選獲得轉(zhuǎn)化有pec-xk99e-hasa-udga2-glms質(zhì)粒的基因工程菌。

32、根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述構(gòu)建方法中，還包括：將質(zhì)粒pxmj19分別進(jìn)行hindⅲ與salⅰ雙酶切，制得線性化質(zhì)粒，將線性化質(zhì)粒與dcas9基因如seq?id?no.4所示，通過無縫克隆進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化宿主菌e.coli?jm109感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行篩選并提取質(zhì)粒，得到重組質(zhì)粒pxmj19-dcas9；

33、設(shè)計osta基因不同干擾強(qiáng)度的sgrna序列，分別為sgrna1、sgrna2和sgrna3基因片段；

34、sgrna1的核苷酸序列如seq?id?no.5所示；

35、sgrna2的核苷酸序列如seq?id?no.6所示；

36、sgrna3的核苷酸序列如seq?id?no.7所示；

37、將重組質(zhì)粒pxmj19-dcas9進(jìn)行bamhⅰ與kpnⅰ雙酶切，制得線性化質(zhì)粒，將線性化質(zhì)粒分別與sgrna1、sgrna2和sgrna3基因片段通過無縫克隆進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化宿主菌e.coli?jm109感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行篩選并提取質(zhì)粒，分別得到重組質(zhì)粒pxmj19-dcas9-ostasgrna1、pxmj19-dcas9-ostasgrna2和pxmj19-dcas9-ostasgrna3；

38、設(shè)計trey基因不同干擾強(qiáng)度的sgrna序列，分別為sgrna4、sgrna5和sgrna6基因片段；

39、sgrna4的核苷酸序列如seq?id?no.8所示；

40、sgrna5的核苷酸序列如seq?id?no.9所示；

41、sgrna6的核苷酸序列如seq?id?no.10所示；

42、將重組質(zhì)粒pxmj19-dcas9進(jìn)行bamhⅰ與kpnⅰ雙酶切，制得線性化質(zhì)粒，將線性化質(zhì)粒分別與sgrna5、sgrna6和sgrna7基因片段通過無縫克隆進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化宿主菌e.coli?jm109感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行篩選并提取質(zhì)粒，分別得到重組質(zhì)粒pxmj19-dcas9-treysgrna4、pxmj19-dcas9-treysgrna5和pxmj19-dcas9-treysgrna6；

43、分別將重組質(zhì)粒pxmj19-dcas9-ostasgrna1、pxmj19-dcas9-ostasgrna2、pxmj19-dcas9-ostasgrna3、pxmj19-dcas9-treysgrna4、pxmj19-dcas9-treysgrna5和pxmj19-dcas9-treysgrna6轉(zhuǎn)化步驟(7)得到的含有pec-xk99e-hasa-udga2-glms質(zhì)粒的基因工程菌，分別篩選獲得轉(zhuǎn)化有pxmj19-dcas9-ostasgrna1、pxmj19-dcas9-ostasgrna2、pxmj19-dcas9-ostasgrna3、pxmj19-dcas9-treysgrna4、pxmj19-dcas9-treysgrna5或pxmj19-dcas9-treysgrna6質(zhì)粒的基因工程菌cgha-z01、cgha-z02、cgha-z03、cgha-z04、cgha-z05或cgha-z06。

44、上述重組谷氨酸棒桿菌在生產(chǎn)透明質(zhì)酸中的應(yīng)用。

45、根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述透明質(zhì)酸分子量為104-106da。

46、上述重組谷氨酸棒桿菌發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法，包括如下步驟：

47、將所得的基因工程菌接種于bhi液體培養(yǎng)基中，28-32℃、150-250rpm條件下培養(yǎng)8-16h，得到一級種子液；將一級種子液以初始o(jì)d562在0.05-0.15之間接入二級種子培養(yǎng)基，在28-32℃、150-250rpm條件下培養(yǎng)8-12h，得到二級種子液；將二級種子液以初始o(jì)d562為0.05-0.15接入發(fā)酵培養(yǎng)基，在28-32℃、150-250rpm條件下培養(yǎng)2-6h，加入iptg終濃度0.1-0.8mm，繼續(xù)培養(yǎng)發(fā)酵24-84h，去除菌體即得到含有透明質(zhì)酸的發(fā)酵液。

48、根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，bhi液體培養(yǎng)基的組分包括：酵母粉2.5g/l，蛋白胨5g/l，氯化鈉5g/l，牛腦心浸液18.5g/l，30mg/l硫酸卡那霉素和15mg/l氯霉素。

49、根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，二級種子培養(yǎng)基的組分包括：葡萄糖20g/l，硫酸銨10g/l，蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，玉米漿粉10g/l，硫酸鎂0.5g/l，磷酸氫二鉀1.5g/l，磷酸二氫鉀1.5g/l，ph＝7。

50、根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，發(fā)酵培養(yǎng)基的組分包括：葡萄糖50g/l，硫酸銨15g/l，蛋白胨5g/l，酵母粉2.5g/l，玉米漿粉10g/l，硫酸鎂0.5g/l，磷酸氫二鉀1.5g/l，磷酸二氫鉀1.5g/l，ph＝7。

51、根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述發(fā)酵液中透明質(zhì)酸產(chǎn)量達(dá)50g/l以上。

52、根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述方法生產(chǎn)的透明質(zhì)酸分子量為104-106da。

53、上述重組谷氨酸棒桿菌生產(chǎn)的透明質(zhì)酸、上述構(gòu)建方法構(gòu)建的重組谷氨酸棒桿菌生產(chǎn)的透明質(zhì)酸或上述生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法生產(chǎn)的透明質(zhì)酸在食品領(lǐng)域、藥品領(lǐng)域或化妝品領(lǐng)域制備含有透明質(zhì)酸的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

54、本發(fā)明的有益效果至少包含如下：

55、本發(fā)明采用了分子生物學(xué)方法和技術(shù)，根據(jù)谷氨酸棒桿菌密碼子偏好重新設(shè)計并化學(xué)合成透明質(zhì)酸合酶hasa基因序列seq?id?no.1、udp-葡萄糖脫氫酶udga2基因序列seqid?no.2和谷氨酰胺-6-磷酸果糖轉(zhuǎn)氨酶glms基因序列seq?id?no.3，同時過表達(dá)以上三個基因可以實現(xiàn)透明質(zhì)酸的高產(chǎn)，在此基礎(chǔ)上，改造谷氨酸棒桿菌的分枝菌酸外層結(jié)構(gòu)(海藻糖以糖脂的形式組成分枝菌酸層)，削弱分支菌酸在高濃度葡萄糖的條件下合成葡萄糖分支菌酸的能力，與此同時不會對菌株生長造成影響，使更多碳源流向透明質(zhì)酸的生物合成，使透明質(zhì)酸的產(chǎn)量正向提升。本發(fā)明方法中谷氨酸棒桿菌宿主對人和動物均無致病性，為食品級安全微生物，合成的透明質(zhì)酸產(chǎn)量高，達(dá)到50g/l以上，并且透明質(zhì)酸分子量低，具有良好的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用前景。