本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥，具體涉及一種用于braf基因沉默的四面體框架核酸復(fù)合物及其制備方法和用途。
背景技術(shù)：
1、甲狀腺癌是最常見(jiàn)的內(nèi)分泌惡性腫瘤。其中，最常見(jiàn)的類型為甲狀腺乳頭狀癌(ptc)，占所有甲狀腺癌的60％-80％。盡管大多數(shù)甲狀腺乳頭狀癌(ptc)患者在接受適當(dāng)治療后預(yù)后良好，但復(fù)發(fā)率仍然顯著，可高達(dá)20％，并且有少數(shù)ptc可能發(fā)展為更具侵襲性的亞型，對(duì)常規(guī)治療產(chǎn)生耐藥性。此外，甲狀腺癌中還有一類罕見(jiàn)類型為甲狀腺未分化癌(atc)，占甲狀腺癌的1％-2％，盡管其在甲狀腺癌中所占比例較小，但其是一種高度侵襲性的亞型，具有接近100％的疾病特異性死亡率，并且目前尚缺乏完善的標(biāo)準(zhǔn)治療方案。針對(duì)atc的積極多模式治療通常僅能提供短期療效，對(duì)長(zhǎng)期生存的改善有限，中位總生存期僅為5個(gè)月。
2、braf基因突變?cè)诩s60％的ptc和45％的atc中被發(fā)現(xiàn)。這一基因改變會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞增殖加速、遷移能力增強(qiáng)、侵襲性提高以及對(duì)凋亡的抵抗。因此，針對(duì)braf基因的治療近年來(lái)受到廣泛關(guān)注?，F(xiàn)有針對(duì)braf基因的治療方法顯示出了顯著的反應(yīng)改善，但往往伴隨嚴(yán)重的不良反應(yīng)和較高的治療成本。因此，迫切需要探索更加有效、安全且經(jīng)濟(jì)可行的治療方案。
3、小干擾rna(sirna)通過(guò)誘導(dǎo)與其互補(bǔ)序列的目標(biāo)mrna的沉默來(lái)啟動(dòng)rna干擾機(jī)制。目前，sirna的使用方法主要包括裸sirna轉(zhuǎn)染、病毒載體遞送、脂質(zhì)體或聚合物納米載體傳遞等。然而，將裸sirna用作治療劑雖然簡(jiǎn)單直接，但面臨諸多限制，包括半衰期短、血漿穩(wěn)定性差以及穿越細(xì)胞膜的困難等。病毒載體遞送效率高，但存在免疫原性和潛在安全風(fēng)險(xiǎn)。脂質(zhì)體或聚合物納米載體能提高穩(wěn)定性和靶向性，但可能引起毒性反應(yīng)，制備過(guò)程復(fù)雜且成本較高。上述方法在效率、安全性及臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化方面仍有改進(jìn)空間。
4、四面體框架核酸(tdn)是一種具有自主入胞性、穩(wěn)定性好、免疫原性低、可編輯性高的三維立體的dna納米材料，可作為藥物載體使用。但目前尚未見(jiàn)運(yùn)用四面體框架核酸結(jié)合sirna，以實(shí)現(xiàn)對(duì)braf基因的沉默，從而治療甲狀腺癌的報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種用于braf基因沉默的四面體框架核酸復(fù)合物及其制備方法和用途。
2、本發(fā)明提供了一種用于braf基因沉默的四面體框架核酸復(fù)合物，它是搭載了sirna的四面體框架核酸；所述sirna的正向序列如seq?id?no.8所示，反向序列如seq?idno.7所示。
3、進(jìn)一步地，所述四面體框架核酸的四條dna單鏈序列如seq?id?no.1、seq?idno.3、seq?id?no.4和seq?id?no.5所示。
4、進(jìn)一步地，所述四面體框架核酸和sirna的摩爾比為1:1。
5、本發(fā)明還提供了一種制備前述的四面體框架核酸復(fù)合物的方法，它包括如下步驟：
6、(1)取四面體框架核酸的四條dna單鏈序列，加入tm緩沖液中，90～95℃保持10～30min，迅速降溫至0～4℃并維持20min以上，得到帶有粘性末端四面體框架核酸；
7、(2)將帶有粘性末端四面體框架核酸與sirna混合后孵育，即得。
8、進(jìn)一步地，步驟(1)中，所述四條dna單鏈序列終濃度均為1μm；
9、和/或，步驟(1)中，所述tm緩沖液的ph值為8.0。
10、進(jìn)一步地，步驟(2)中，所述帶有粘性末端四面體框架核酸與sirna的摩爾比為1:1；
11、和/或，步驟(2)中，所述孵育為25～37℃孵育20～30min。
12、本發(fā)明還提供了前述的四面體框架核酸復(fù)合物在制備用于braf基因沉默的藥物中的用途。
13、本發(fā)明還提供了前述的四面體框架核酸復(fù)合物在制備預(yù)防和/或治療與braf基因沉默相關(guān)的疾病的藥物中的用途；
14、優(yōu)選地，所述與braf基因沉默相關(guān)的疾病為癌癥。
15、進(jìn)一步地，所述與braf基因沉默相關(guān)的疾病為甲狀腺癌；
16、優(yōu)選地，所述甲狀腺癌為甲狀腺乳頭狀癌、甲狀腺未分化癌。
17、本發(fā)明還提供了一種預(yù)防和/或治療甲狀腺癌的藥物，它是以前述的四面體框架核酸復(fù)合物為活性成分，加上藥學(xué)上可接受的輔料制備而成。
18、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：
19、(1)本發(fā)明首次構(gòu)建了一種新型納米藥物系統(tǒng)tdn-sibraf，其中sibraf通過(guò)黏性末端與tdn相互結(jié)合，在tdn的頂點(diǎn)攜帶1個(gè)sirna(sibraf)。
20、(2)在tdn-sibraf納米載藥系統(tǒng)中，tdn可以提高sirna(sibraf)的入胞能力以及穩(wěn)定性，從而增強(qiáng)體系對(duì)抑制癌細(xì)胞的增殖和侵襲、促進(jìn)細(xì)胞凋亡的能力。
21、(3)tdn-sibraf治療可以有效抑制mek-erk信號(hào)通路的活化，從而導(dǎo)致線粒體功能障礙和dna損傷水平升高。
22、(4)tdn-sibraf治療在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中均未表現(xiàn)出明顯的毒性作用。
23、(5)tdn-sibraf治療可以有效抑制體內(nèi)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，其具體機(jī)制包括抑制癌細(xì)胞的增殖和侵襲、促進(jìn)細(xì)胞凋亡。
24、綜上，本發(fā)明tdn-sibraf復(fù)合物能夠富集在腫瘤部位，被癌癥細(xì)胞有效攝取，通過(guò)抑制braf表達(dá)、抑制癌細(xì)胞的增殖和侵襲、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抑制mek-erk信號(hào)通路的活化，提高線粒體功能障礙和dna損傷水平，表現(xiàn)出良好的協(xié)同增效抗腫瘤效果。同時(shí)，本發(fā)明tdn-sibraf復(fù)合物具有良好的生物安全性和生物相容性。因此，本發(fā)明tdn-sibraf復(fù)合物適用于甲狀腺癌相關(guān)藥物的制備，具有良好的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用前景。
25、顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
26、以下通過(guò)實(shí)施例形式的具體實(shí)施方式，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
1.一種用于braf基因沉默的四面體框架核酸復(fù)合物，其特征在于：它是搭載了sirna的四面體框架核酸；所述sirna的正向序列如seq?id?no.8所示，反向序列如seq?id?no.7所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的四面體框架核酸復(fù)合物，其特征在于：所述四面體框架核酸的四條dna單鏈序列如seq?id?no.1、seq?id?no.3、seq?id?no.4和seq?id?no.5所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的四面體框架核酸復(fù)合物，其特征在于：所述四面體框架核酸和sirna的摩爾比為1:1。
4.一種制備權(quán)利要求1～3任一項(xiàng)所述的四面體框架核酸復(fù)合物的方法，其特征在于：它包括如下步驟：
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于：步驟(1)中，所述四條dna單鏈序列終濃度均為1μm；
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于：步驟(2)中，所述帶有粘性末端四面體框架核酸與sirna的摩爾比為1:1；
7.權(quán)利要求1～3任一項(xiàng)所述的四面體框架核酸復(fù)合物在制備用于braf基因沉默的藥物中的用途。
8.權(quán)利要求1～3任一項(xiàng)所述的四面體框架核酸復(fù)合物在制備預(yù)防和/或治療與braf基因沉默相關(guān)的疾病的藥物中的用途；
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的用途，其特征在于：所述與braf基因沉默相關(guān)的疾病為甲狀腺癌；
10.一種預(yù)防和/或治療甲狀腺癌的藥物，其特征在于：它是以權(quán)利要求1～3任一項(xiàng)所述的四面體框架核酸復(fù)合物為活性成分，加上藥學(xué)上可接受的輔料制備而成。