本發(fā)明涉及一種包裹特定mirna的脂質(zhì)納米粒及其在神經(jīng)損傷治療藥物中的應(yīng)用，屬于生物醫(yī)藥。

背景技術(shù)：

1、神經(jīng)再生修復(fù)是損傷后恢復(fù)功能的關(guān)鍵領(lǐng)域，尤其在脊髓損傷(spinal?cordinjury，sci)中，其研究具有重要意義。sci是一種嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central?nervoussystem，cns)損傷，通常導(dǎo)致?lián)p傷水平以下的運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)或自主功能喪失。據(jù)2024年who報(bào)道目前全球有超過(guò)1500萬(wàn)人患有sci，發(fā)病率和死亡率逐年上升。有效的預(yù)防、治療、康復(fù)和持續(xù)的醫(yī)療保健對(duì)于減輕全球sci負(fù)擔(dān)至關(guān)重要。與周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)(peripheral?nervoussystem，pns)的神經(jīng)損傷不同，pns在發(fā)生沃勒氏變性后，斷裂的軸突可能會(huì)重新長(zhǎng)入遠(yuǎn)端神經(jīng)鞘，并重新支配周?chē)悬c(diǎn)。而成人cns的可塑性低，神經(jīng)元再生有限，損傷后的再生極其薄弱。經(jīng)多年的研究，目前認(rèn)為創(chuàng)傷性sci可通過(guò)長(zhǎng)距離軸突再生，構(gòu)建新的局部中繼神經(jīng)回路(通過(guò)使用外源性神經(jīng)干細(xì)胞/祖細(xì)胞(nsc)或使用內(nèi)源性nsc來(lái)實(shí)現(xiàn))。但各種策略的復(fù)雜性導(dǎo)致其臨床可實(shí)施性極低，因此開(kāi)發(fā)安全有效的臨床治療方法促進(jìn)神經(jīng)可塑性、神經(jīng)發(fā)生和重建受損神經(jīng)回路的治療策略對(duì)于改善sci后的神經(jīng)愈合都是必要的。

2、近年來(lái)，神經(jīng)損傷再生修復(fù)的研究逐漸聚焦于多個(gè)方面，包括促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞再生、修復(fù)損傷區(qū)域的神經(jīng)連接以及重建神經(jīng)功能。生物材料的應(yīng)用、細(xì)胞治療和基因編輯技術(shù)等前沿手段為神經(jīng)再生治療提供了新的可能。在神經(jīng)系統(tǒng)中各種轉(zhuǎn)錄因子、dna甲基化和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的表觀遺傳修飾因子以及微小rna(mirna)的活性與促再生轉(zhuǎn)錄程序的激活有關(guān)。mirna的表達(dá)依賴于組織和環(huán)境。特定的mirna在神經(jīng)發(fā)育中起著關(guān)鍵作用，并按照這些作用相對(duì)應(yīng)的時(shí)間和空間以特定方式表達(dá)。在神經(jīng)損傷的代表性疾病sci中，創(chuàng)傷發(fā)生后，幾個(gè)看似獨(dú)立的生物過(guò)程(例如軸突變性/再生、炎癥、細(xì)胞死亡、髓鞘損失)相互交織，在這種情況下，mirna就像一個(gè)完美協(xié)調(diào)的網(wǎng)絡(luò)，每個(gè)mirna可以作用于不同的mrna，并且一個(gè)分子也可以被多個(gè)mirna靶向，因此mirna作為內(nèi)部調(diào)控系統(tǒng)，可以精確控制不同的神經(jīng)過(guò)程，協(xié)調(diào)它們的作用以調(diào)控復(fù)雜的基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。因此sci后找尋特定的mirna分子在體調(diào)控，可以促進(jìn)軸突再生的功能整合，以改善sci后的神經(jīng)愈合。間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體已被證明在sci后神經(jīng)修復(fù)治療中發(fā)揮積極作用，而外泌體是穩(wěn)定的mirna來(lái)源，那么外泌體中是否具有通用型功能性治療的核酸分子值得進(jìn)一步研究，能達(dá)到治療效用可進(jìn)一步開(kāi)發(fā)應(yīng)用。

3、mirna、mrna、質(zhì)粒dna等核酸藥物為基因治療提供了治療潛力。然而，裸露的核酸藥物在循環(huán)中不穩(wěn)定、易降解，rna、dna等生物材料所帶的負(fù)電荷限制了它們穿過(guò)同樣帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜，基于此在sci中應(yīng)用安全有效的遞送載體傳遞治療性mirna分子是必要的。脂質(zhì)納米粒(lnp)是一種非凡的載體，自新冠病毒感染mrna疫苗的獲批，lnp加速了mrna在人體中的應(yīng)用，與其他載體相比，lnp具有包封率高、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、制備簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)。可電離的脂質(zhì)分子被設(shè)計(jì)為lnp的主要成分，lnp在特定ph下通過(guò)相轉(zhuǎn)化釋放其核酸內(nèi)容物以發(fā)揮調(diào)控治療作用。目前fda僅批準(zhǔn)了三種用于rna遞送的可電離陽(yáng)離子脂質(zhì)。sm-102和alc-0315是首批投入臨床領(lǐng)域遞送mrna的單胺脂質(zhì)。關(guān)于lnp的治療應(yīng)用主要集中于mrna的遞送疫苗開(kāi)發(fā)及腫瘤治療研究中，利用lnp的遞送性質(zhì)傳遞mirna治療分子，在神經(jīng)損傷再生修復(fù)治療研究中值得被探索。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種包裹特定mirna的脂質(zhì)納米粒及其在神經(jīng)損傷治療藥物中的應(yīng)用，以神經(jīng)損傷模型--sci為例驗(yàn)證其療效。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體促進(jìn)神經(jīng)損傷修復(fù)已被證明具有積極作用，因此本發(fā)明的首要目的在于利用外泌體中的積極有效治療成分—mirna，以lnp為遞送載體，以lnp-mirna-mimics形式治療神經(jīng)損傷，提供治療神經(jīng)損傷的新方法。

2、本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

3、一種包裹特定mirna的脂質(zhì)納米粒，所述特定mirna為mirna的分子模擬物，即mirnamimics，包括has-mir939-5p?mimics、has-mir665?mimics、has-mir185-3p?mimics。

4、優(yōu)選的，所述has-mir939-5p?mimics正義鏈的核酸序列如seq?id?no.1所示，反義鏈的核苷酸序列如seq?id?no.2所示；所述has-mir665?mimics正義鏈的核酸序列如seq?idno.3所示，反義鏈的核苷酸序列如seq?id?no.4所示；所述has-mir185-3p?mimics正義鏈的核酸序列如seq?id?no.5所示，反義鏈的核苷酸序列如seq?id?no.6所示。

5、優(yōu)選的，所述脂質(zhì)納米粒的脂質(zhì)成分包括：alc-0315、dspc、膽固醇、alc-0159。

6、進(jìn)一步優(yōu)選的，所述alc-0315、dspc、膽固醇、alc-0159的摩爾比為46.3：9.4：42.7：1.6。

7、本發(fā)明中，所述的包裹特定mirna的脂質(zhì)納米粒lnp-mirna-mimics的粒徑范圍為50～125nm，分散性指數(shù)(pdi)小于0.2，zeta電位范圍為-15～+15mv。

8、上述包裹特定mirna的脂質(zhì)納米粒的制備方法，包括如下步驟：

9、1)將alc-0315、dspc、膽固醇、alc-0159以乙醇為溶劑分別配制為脂質(zhì)儲(chǔ)備液，按比例混合后配置為復(fù)方-乙醇溶液；

10、2)利用檸檬酸鈉緩沖液將mirnamimics稀釋至工作濃度，得到水相溶液；

11、3)將復(fù)方-乙醇溶液和水相溶液混合，自主形成lnp-mirna-mimics復(fù)合物，并利用pbs緩沖液稀釋?zhuān)?/p>

12、4)通過(guò)超濾將lnp-mirna-mimics復(fù)合物利用pbs緩沖液置換，使乙醇含量降至0.5％以下，然后濃縮；

13、5)向濃縮后的lnp-mirna-mimics復(fù)合物中添加蔗糖作為冷凍保護(hù)劑，經(jīng)0.22μm過(guò)濾后得到包裹特定mirna的脂質(zhì)納米粒，即lnp-mirna-mimics。

14、優(yōu)選的，步驟1)中所述的脂質(zhì)儲(chǔ)備液濃度為5～12.5mg/ml。

15、進(jìn)一步優(yōu)選的，步驟1)中所述的脂質(zhì)儲(chǔ)備液濃度為10mg/ml。

16、優(yōu)選的，步驟2)中所述的水相溶液中has-mir939-5p?mimics、has-mir665mimics、has-mir185-3p?mimics的質(zhì)量比為1:1:1，水相溶液中總mirnamimics的工作濃度以步驟3)所述的lnp-mirna-mimics復(fù)合物中包含0.4～1mg/ml的lnp-mirna-mimics計(jì)算配制。

17、進(jìn)一步優(yōu)選的，水相溶液中總mirnamimics的工作濃度以步驟3)所述的lnp-mirna-mimics復(fù)合物中包含0.5mg/ml的lnp-mirna-mimics計(jì)算配制。

18、優(yōu)選的，步驟3)中所述的pbs緩沖液稀釋為加入lnp-mirna-mimics復(fù)合物2～3倍體積的pbs緩沖液進(jìn)行稀釋?zhuān)员３謑np-mirna-mimics復(fù)合物穩(wěn)定性，否則高濃度的乙醇會(huì)造成脂質(zhì)納米粒融合；所述的pbs緩沖液的ph為6.9～7.9。

19、優(yōu)選的，步驟4)中所述的超濾為使用100kda超濾離心管3000～4000×g離心10～15min；所述的pbs緩沖液的ph為6.9～7.9。

20、優(yōu)選的，步驟5)中所述的蔗糖濃度為最終溶液中含8％～10％蔗糖，輕輕混勻后保存。

21、進(jìn)一步優(yōu)選的，步驟5)中所述的蔗糖濃度為最終溶液中含10％蔗糖。

22、上述包裹特定mirna的脂質(zhì)納米粒在制備神經(jīng)損傷治療藥物中的應(yīng)用。

23、優(yōu)選的，所述包裹特定mirna的脂質(zhì)納米粒能夠促進(jìn)神經(jīng)損傷再生修復(fù)；

24、進(jìn)一步優(yōu)選的，所述包裹特定mirna的脂質(zhì)納米粒能夠促進(jìn)脊髓損傷后的行為恢復(fù)、肌肉恢復(fù)及損傷部位的神經(jīng)元恢復(fù)。

25、有益效果：

26、(1)間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體已被證明在治療神經(jīng)性損傷中發(fā)揮積極作用，本發(fā)明在前期研究中發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體中的特定mirna可以作為神經(jīng)損傷的有效治療成分，所述的mirna包括has-mir939-5p、has-mir665、has-mir185-3p?；诖耍景l(fā)明直接利用外泌體中的有效成分mirna的分子模擬物(mirnamimics)，提供了一種脂質(zhì)納米粒遞送特定mirna體系(lnp-mirna-mimics)用于治療神經(jīng)損傷，不僅克服了直接利用外泌體治療的異質(zhì)性問(wèn)題，還解決了外泌體產(chǎn)出率低、大規(guī)模生產(chǎn)純化困難等問(wèn)題，通過(guò)lnp遞送方式實(shí)現(xiàn)lnp-mirna-mimics在神經(jīng)損傷治療中的應(yīng)用，實(shí)現(xiàn)了單純成分治療策略，進(jìn)一步開(kāi)發(fā)lnp治療神經(jīng)損傷的應(yīng)用價(jià)值。

27、(2)本發(fā)明采用可電離脂質(zhì)alc-0315、輔助脂質(zhì)dspc、結(jié)構(gòu)脂質(zhì)膽固醇和聚乙二醇脂質(zhì)alc-0159為載體制備了lnp-mirna-mimics治療體系，mirna?mimics是來(lái)源于臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體中的mirna的分子模擬物，其中包含has-mir939-5p?mimics、has-mir665mimics、has-mir185-3p?mimics三類(lèi)mimics。相較于直接將臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體應(yīng)用于治療神經(jīng)損傷，lnp-mirna-mimics治療體系更加均一，重復(fù)性好，是良好的遞送治療方案。