本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)害蟲防治，尤其涉及基于甜菜夜蛾atp酶a基因dsrna的納米制劑及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
1、甜菜夜蛾（spodoptera?exigua）在全球范圍內(nèi)普遍存在，并且能夠侵害多種植物。其幼蟲具有雜食性，主要以幼蟲形態(tài)對(duì)農(nóng)作物造成損害，影響玉米、花生、芝麻、甜菜及眾多蔬菜的生長(zhǎng)。甜菜夜蛾的幼蟲表現(xiàn)出假死行為和隱蔽進(jìn)食的習(xí)慣，這使得它們難以被傳統(tǒng)的化學(xué)殺蟲劑有效控制。由于長(zhǎng)期依賴化學(xué)農(nóng)藥，甜菜夜蛾已經(jīng)產(chǎn)生對(duì)多種殺蟲劑的抗性，包括有機(jī)磷類、擬除蟲菊酯類、氨基甲酸酯類和苯甲酰脲類等。此外，化學(xué)殺蟲劑的過(guò)量使用還可能帶來(lái)環(huán)境和健康方面的威脅。因此，推進(jìn)作物綠色防控技術(shù)的研究與應(yīng)用，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中對(duì)關(guān)鍵害蟲的治理具有極其重要的價(jià)值。
2、rna農(nóng)藥是基于rna干擾（rna?interference，簡(jiǎn)稱rnai）技術(shù)開發(fā)的農(nóng)藥，設(shè)計(jì)針對(duì)特定害蟲或病原體基因的小干涉rna分子，通過(guò)特異性地識(shí)別并結(jié)合到目標(biāo)基因的mrna上，促使mrna降解或翻譯抑制，發(fā)揮病蟲害防治的效果。由于其高效、專一、環(huán)境友好以及研發(fā)成本效益高的特點(diǎn)，rna農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)害蟲和病害的防控中顯示出巨大的發(fā)展?jié)摿?。在農(nóng)業(yè)應(yīng)用中，rna農(nóng)藥可以通過(guò)多種途徑實(shí)施，包括通過(guò)轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生雙鏈rna（dsrna）、利用病毒或微生物傳遞dsrna，以及直接噴灑外源性dsrna等方法。
3、rna農(nóng)藥在自然環(huán)境中容易分解，雖然對(duì)環(huán)境的污染和殘留風(fēng)險(xiǎn)極低，滿足了綠色農(nóng)業(yè)的需求，但是在實(shí)際應(yīng)用中確實(shí)存在一些挑戰(zhàn)，限制了其大規(guī)模推廣。首先，dsrna分子自然環(huán)境中易受多種因素影響，導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)變化或降解，因此需要開發(fā)特殊的保護(hù)配方以增強(qiáng)其在環(huán)境中的穩(wěn)定性。其次，實(shí)現(xiàn)dsrna對(duì)目標(biāo)害蟲的高效和精確傳遞是一個(gè)重大挑戰(zhàn)。害蟲體內(nèi)的核酸酶活性和ph變化等因素可能會(huì)破壞dsrna，從而降低rna農(nóng)藥在害蟲體內(nèi)的干擾效果。最后，dsrna的生產(chǎn)成本較高，這影響了其在農(nóng)業(yè)中的廣泛應(yīng)用。因此提升dsrna傳遞效率、增強(qiáng)dsrna的環(huán)境穩(wěn)定性、優(yōu)化dsrna的遞送方式是rna農(nóng)藥領(lǐng)域亟待解決的問(wèn)題。
4、納米農(nóng)藥是一種新型農(nóng)藥制劑，它通過(guò)納米技術(shù)和材料科學(xué)的應(yīng)用，將活性成分、載體以及輔助成分精確配比，以創(chuàng)造出高效且性能優(yōu)越的農(nóng)藥產(chǎn)品。納米農(nóng)藥技術(shù)已經(jīng)催生了一系列創(chuàng)新的制劑形式，包括納米乳液、懸浮液、微膠囊、水溶性凝膠和固體分散體系等。這些新型制劑能夠顯著提升農(nóng)藥的效能，平均藥效可提高30-50%，并且能夠?qū)⑺幮С掷m(xù)時(shí)間延長(zhǎng)至原來(lái)的4-5倍，同時(shí)還能大幅度減少農(nóng)藥在環(huán)境中的殘留污染。納米載體能夠有效保護(hù)dsrna，防止其受到環(huán)境因素的影響，例如光照、溫度波動(dòng)和核酸酶的降解，從而增強(qiáng)dsrna在環(huán)境中的穩(wěn)定性。此外，納米載體的應(yīng)用有助于減少對(duì)傳統(tǒng)化學(xué)農(nóng)藥的依賴，從而降低環(huán)境污染和對(duì)非靶標(biāo)生物的負(fù)面影響。
5、在當(dāng)前的研究背景下，開發(fā)一種能夠利用rnai技術(shù)來(lái)高效控制甜菜夜蛾的dsrna分子及其相應(yīng)的納米殺蟲劑，已成為本領(lǐng)域迫切需要攻克的技術(shù)挑戰(zhàn)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、為了攻克上述技術(shù)挑戰(zhàn)，本發(fā)明提供了一種甜菜夜蛾atp酶a基因，其核苷酸序列如seq?id?no.1所示。
2、本發(fā)明通過(guò)對(duì)甜菜夜蛾不同靶基因的大量篩選，發(fā)現(xiàn)針對(duì)甜菜夜蛾atp酶a基因設(shè)計(jì)的dsrna分子能夠高效沉默基因表達(dá)，經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，采用seq?id?no.1所示基因序列經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄合成的dsrna能導(dǎo)致甜菜夜蛾蛻皮異常和體型變小而死亡，對(duì)甜菜夜蛾具有較高的致死率。
3、進(jìn)一步，本發(fā)明提供了由seq?id?no.1所示基因序列合成的dsrna。
4、同時(shí)，本發(fā)明提供了用于擴(kuò)增獲得權(quán)利要求1所述甜菜夜蛾atp酶a基因的引物對(duì)，所述引物對(duì)如seq?id?no.2和seq?id?no.3所示。
5、進(jìn)一步，本發(fā)明提供了所述dsrna的合成方法，包括：提取甜菜夜蛾的總rna，反轉(zhuǎn)錄獲得cdna作為模板，采用seq?id?no.2和seq?id?no.3所示的引物對(duì)進(jìn)行pcr擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物純化后作為模板序列合成dsrna。
6、在一些實(shí)施方案中，通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄合成dsrna。
7、進(jìn)一步，本發(fā)明提供了含有所述dsrna的殺蟲劑。
8、在一些實(shí)施方案中，所述殺蟲劑的制劑類型為納米制劑、粉劑、顆粒劑、水乳劑、氣霧劑或乳油劑。
9、在一些實(shí)施方案中，所述納米制劑中包括所述的dsrna以及納米載體。
10、優(yōu)選地，所述納米載體為殼聚糖。
11、優(yōu)選地，所述殺蟲劑的制備方法包括：將殼聚糖、乙酸和乙酸鈉混合制備成殼聚糖溶液；然后將所述殼聚糖溶液與dsrna溶液混合，經(jīng)靜置、溫育、混勻、再靜置以及離心沉淀制得。
12、采用上述方法制備的納米殺蟲劑，對(duì)dsrna保護(hù)性強(qiáng)和高效的滲透能力，并且操作過(guò)程簡(jiǎn)單，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)特定基因表達(dá)的精確抑制。飼喂處理后48h，基因沉默效率達(dá)63%，最終導(dǎo)致甜菜夜蛾蛻皮異常、體型異常并且出現(xiàn)拒食而死亡。
13、優(yōu)選地，所述殼聚糖溶液的濃度為0.05%~0.5%（w/v），更優(yōu)選為0.05%~0.2%。
14、優(yōu)選地，所述dsrna溶液的濃度為1000~5000ng/μl，更優(yōu)選為2000~4000ng/μl。
15、優(yōu)選地，所述殼聚糖溶液與dsrna溶液按照質(zhì)量比（0.5~4）：1混合。
16、優(yōu)選地，所述靜置的時(shí)間為2min以上。
17、優(yōu)選地，所述溫育的溫度為50~60℃，優(yōu)選為52~58℃。
18、優(yōu)選地，所述溫育的時(shí)間為1min以上。
19、優(yōu)選地，所述離心的時(shí)間為10s~50s，更優(yōu)選為25s~35s。
20、優(yōu)選地，所述再靜置為在室溫下靜置1h以上。
21、優(yōu)選地，所述離心的溫度為2~6℃，轉(zhuǎn)速為12000rpm以上。
22、優(yōu)選地，所述離心的時(shí)間為10min以上。
23、進(jìn)一步，本發(fā)明提供了所述的甜菜夜蛾atp酶a基因、所述的dsrna、所述的殺蟲劑或所述制備方法制得的殺蟲劑在農(nóng)業(yè)害蟲管理、農(nóng)業(yè)害蟲防治或致死農(nóng)業(yè)害蟲中的應(yīng)用。
24、優(yōu)選地，所述農(nóng)業(yè)害蟲為鱗翅目害蟲，更優(yōu)選為甜菜夜蛾。
25、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于：
26、本發(fā)明提供了一種能夠利用rnai技術(shù)高效防治甜菜夜蛾的dsrna分子，該技術(shù)展現(xiàn)出對(duì)靶標(biāo)基因的高度特異性和的強(qiáng)基因沉默能力。利用這一技術(shù)開發(fā)的納米殺蟲劑能有效對(duì)抗甜菜夜蛾，具有顯著的致死效果和較快的殺蟲速度。其簡(jiǎn)便的操作流程不僅減少了傳統(tǒng)化學(xué)殺蟲劑對(duì)環(huán)境和健康的潛在風(fēng)險(xiǎn)，還滿足了現(xiàn)代農(nóng)業(yè)對(duì)可持續(xù)發(fā)展的需求，本發(fā)明對(duì)甜菜夜蛾的防控具有重大的實(shí)踐價(jià)值。
1.一種甜菜夜蛾atp酶a基因，其特征在于，其核苷酸序列如seq?id?no.1所示。
2.由權(quán)利要求1所述的甜菜夜蛾atp酶a基因合成的dsrna。
3.用于擴(kuò)增獲得權(quán)利要求1所述甜菜夜蛾atp酶a基因的引物對(duì)，其特征在于，所述引物對(duì)如seq?id?no.2和seq?id?no.3所示。
4.權(quán)利要求2所述dsrna的合成方法，其特征在于，包括：提取甜菜夜蛾的總rna，反轉(zhuǎn)錄獲得cdna作為模板，采用seq?id?no.2和seq?id?no.3所示的引物對(duì)進(jìn)行pcr擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物純化后作為模板序列合成dsrna。
5.一種殺蟲劑，其特征在于，其中含有權(quán)利要求2所述的dsrna。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的殺蟲劑，其特征在于，所述殺蟲劑的制劑類型為納米制劑、粉劑、顆粒劑、水乳劑、氣霧劑或乳油劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的殺蟲劑，其特征在于，所述納米制劑中包括權(quán)利要求2所述的dsrna以及納米載體。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的殺蟲劑，其特征在于，所述納米載體為殼聚糖。
9.權(quán)利要求8所述殺蟲劑的制備方法，其特征在于，包括：將殼聚糖、乙酸和乙酸鈉混合制備成殼聚糖溶液；然后將所述殼聚糖溶液與dsrna溶液混合，經(jīng)靜置、溫育、混勻、再靜置以及離心沉淀制得。
10.權(quán)利要求1所述的甜菜夜蛾atp酶a基因、權(quán)利要求2所述的dsrna、權(quán)利要求5~8中任一項(xiàng)所述的殺蟲劑或權(quán)利要求9所述制備方法制得的殺蟲劑在農(nóng)業(yè)害蟲管理、農(nóng)業(yè)害蟲防治或致死農(nóng)業(yè)害蟲中的應(yīng)用。