本發(fā)明涉及基因工程，具體地，本發(fā)明涉及一種特異性敲除犬pc4基因的犬乳腺腫瘤細(xì)胞模型及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、犬乳腺腫瘤發(fā)病率高，多數(shù)患犬預(yù)后不良，嚴(yán)重危害著犬的身體健康。研究犬乳腺腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，對(duì)于犬乳腺腫瘤的診斷和治療具有重要意義。轉(zhuǎn)錄輔助因子4(positive?coactivator?4，pc4)是一種核蛋白，廣泛存在于酵母、哺乳動(dòng)物和人類各組織細(xì)胞核中。其結(jié)構(gòu)高度保守，能參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、dna復(fù)制、dna修復(fù)過(guò)程。近年來(lái)，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)pc4與人的各種腫瘤密切相關(guān)，如乳腺癌、肺癌、前列腺癌等。專利cn101377487a公開(kāi)了pc4基因在肺癌、乳腺癌、前列腺癌等多種人類腫瘤組織中均高表達(dá)，pc4基因可用于多種腫瘤的檢測(cè)標(biāo)志基因，特別是可作為晚期腫瘤骨轉(zhuǎn)移腫瘤的預(yù)警的標(biāo)志分子。專利cn116840486a公開(kāi)了針對(duì)人pc4蛋白ser?17位點(diǎn)磷酸化，制備了特異性的抗原肽和抗體，可應(yīng)用于調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖或生長(zhǎng)，可作為或用于開(kāi)發(fā)臨床腫瘤疾病的診斷與治療產(chǎn)品。專利cn116953237a公開(kāi)了pc4蛋白的lys68位點(diǎn)泛素化水平在腫瘤細(xì)胞或組織中顯著升高，可作為診斷靶點(diǎn)與指標(biāo)；并且lys68位點(diǎn)泛素化會(huì)增強(qiáng)pc4與rna結(jié)合能力，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)展、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖，顯著促進(jìn)腫瘤的惡性表型轉(zhuǎn)化、促進(jìn)腫瘤惡性進(jìn)展，抑制該位點(diǎn)泛素化的方案可用于開(kāi)發(fā)腫瘤治療藥物。但目前并未見(jiàn)pc4與犬乳腺腫瘤關(guān)系的相關(guān)研究。因此，提供一種敲除犬pc4的犬乳腺腫瘤細(xì)胞系，為深入研究犬pc4的基因功能、犬乳腺腫瘤的疾病機(jī)制具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述缺陷和不足，提供一種特異性敲除犬pc4基因的sgrna。

2、本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供一種特異性敲除犬pc4基因的犬乳腺腫瘤細(xì)胞模型的構(gòu)建方法。

3、本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供上述構(gòu)建方法制備得到的特異性敲除犬pc4基因的犬乳腺腫瘤細(xì)胞模型。

4、本發(fā)明的第四個(gè)目的在于提供上述犬乳腺腫瘤細(xì)胞模型在探究犬乳腺腫瘤發(fā)病機(jī)制中的應(yīng)用。

5、本發(fā)明的第五個(gè)目的在于提供上述犬乳腺腫瘤細(xì)胞模型在篩選和制備治療犬乳腺腫瘤的藥物中的應(yīng)用。

6、本發(fā)明的上述目的是通過(guò)以下技術(shù)方案給予實(shí)現(xiàn)的：

7、本發(fā)明提供一種特異性敲除犬pc4基因的sgrna，所述sgrna的核苷酸序列如seqid?no.2或seq?id?no.3所示。

8、轉(zhuǎn)錄輔助因子4(positive?coactivator?4，pc4)是一種核蛋白，廣泛存在于酵母、哺乳動(dòng)物和人類各組織細(xì)胞核中，其結(jié)構(gòu)高度保守，能參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、dna復(fù)制、dna修復(fù)過(guò)程。本發(fā)明在ncbi網(wǎng)站中下載犬pc4(gene?id：479283)的基因序列，設(shè)計(jì)sgrna，并構(gòu)建pc4(犬)敲除慢病毒，轉(zhuǎn)染犬乳腺腫瘤細(xì)胞系，篩選獲得pc4成功敲除的犬乳腺腫瘤細(xì)胞系，為pc4與犬乳腺腫瘤的相關(guān)研究提供研究模型。該細(xì)胞模型可用于深入研究犬pc4的基因功能、犬乳腺腫瘤的疾病機(jī)制，還能進(jìn)行犬乳腺腫瘤的藥物開(kāi)發(fā)，為犬乳腺腫瘤的治療探索新的策略。因此，設(shè)計(jì)一種特異性敲除犬pc4基因的sgrna對(duì)于構(gòu)建一種特異性敲除犬pc4基因的犬乳腺腫瘤細(xì)胞模型有重要意義。

9、本發(fā)明提供一種特異性敲除犬pc4基因的犬乳腺腫瘤細(xì)胞模型的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

10、s1.將上述sgrna克隆到lenticrispr?v2-puro載體中，得到重組質(zhì)粒；

11、s2.利用將步驟s1的重組質(zhì)粒與pmd2.g和pspax2質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，培養(yǎng)并收集病毒上清液；

12、s3.利用步驟s2的病毒上清液轉(zhuǎn)染犬乳腺腫瘤細(xì)胞，并篩選pc4成功敲除細(xì)胞系。

13、進(jìn)一步地，所述步驟s2中病毒上清液中病毒滴度大于108tu/ml。

14、進(jìn)一步地，所述步驟s2中重組質(zhì)粒與pmd2.g和pspax2質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞的方法為將重組質(zhì)粒與pmd2.g和pspax2質(zhì)粒混合并用lipofectaminetm?2000轉(zhuǎn)染到293t細(xì)胞中。

15、進(jìn)一步地，所述步驟s2中培養(yǎng)的時(shí)間為45～50h。

16、進(jìn)一步地，所述步驟s3中犬乳腺腫瘤細(xì)胞為chmp細(xì)胞系。

17、更進(jìn)一步地，所述chmp細(xì)胞的密度為30％。

18、進(jìn)一步地，所述步驟s3中轉(zhuǎn)染的時(shí)間為45～50h。

19、進(jìn)一步地，所述步驟s3中轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)液為體積比1:0.9～1.1的2％fbs完全培養(yǎng)基和moi＝10的慢病毒。

20、更進(jìn)一步地，所述步驟s3中轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)液為50％體積的2％fbs完全培養(yǎng)基和50％體積的moi＝10慢病毒。

21、進(jìn)一步地，所述步驟s3中篩選的方法為嘌呤霉素篩選、pcr擴(kuò)增并測(cè)序或westernblot驗(yàn)證。

22、進(jìn)一步地，所述pcr擴(kuò)增的引物如seq?id?no.7～10所示。

23、更進(jìn)一步地，所述步驟s3中嘌呤霉素(puro)藥物篩選的方法為將培養(yǎng)液換成含2ug/ml?puro的2％fbs完全培養(yǎng)基開(kāi)始進(jìn)行藥物抗性篩選，并每隔1～2天更換新鮮的含puro的完全培養(yǎng)基，持續(xù)篩選一周。無(wú)細(xì)胞死亡即表示細(xì)胞被成功轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒。

24、更進(jìn)一步地，所述步驟s3中pcr擴(kuò)增并測(cè)序的方法為取部分細(xì)胞提取rna，反轉(zhuǎn)錄為cdna后，使用對(duì)應(yīng)的引物進(jìn)行pcr驗(yàn)證，并測(cè)序；或?qū)cr結(jié)果通過(guò)瓊脂糖核酸電泳分離后，切下大小正確且熒光信號(hào)強(qiáng)的條帶進(jìn)行膠回收，將回收產(chǎn)物進(jìn)行基因克隆，轉(zhuǎn)化后挑單菌落，并測(cè)序。

25、更進(jìn)一步地，所述步驟s3中western?blot驗(yàn)證的方法為取部分細(xì)胞提取蛋白，western?blot驗(yàn)證是否表達(dá)pc4。具體為，通過(guò)基因測(cè)序檢測(cè)sgrna是否切割，接著將成功切割sgrna的chmp進(jìn)行單克隆篩選，最后用western?blot來(lái)驗(yàn)證pc4是否敲除成功。基因測(cè)序結(jié)果表明sgrna成功被切割，western?blot結(jié)果表明單克隆細(xì)胞系沒(méi)有pc4的表達(dá)，則pc4成功被敲除。

26、本發(fā)明還提供上述構(gòu)建方法制備得到的特異性敲除犬pc4基因的犬乳腺腫瘤細(xì)胞模型。

27、犬乳腺腫瘤嚴(yán)重危害著犬的身體健康，研究犬乳腺腫瘤的發(fā)生和發(fā)展對(duì)于犬乳腺腫瘤的診斷和治療具有重要意義。pc4被發(fā)現(xiàn)與人類多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，但目前未見(jiàn)pc4與犬腫瘤關(guān)系的相關(guān)研究。因此，本發(fā)明旨在構(gòu)建敲除pc4的犬乳腺腫瘤細(xì)胞系chmp(chmp是經(jīng)典的犬乳腺腫瘤細(xì)胞系)，為pc4與犬乳腺腫瘤的相關(guān)研究提供研究模型。敲除pc4的chmp細(xì)胞系可以應(yīng)用于以下場(chǎng)景：

28、(1)敲除犬pc4的chmp可以用于確定pc4在犬乳腺腫瘤中增殖、凋亡、遷移和侵襲中所起的作用，還可以確定pc4調(diào)控這些功能時(shí)的具體信號(hào)通路。

29、(2)敲除犬pc4的chmp可以用于評(píng)估靶向pc4或pc4上下游靶點(diǎn)藥物的有效性和特異性，還可以用于篩選和優(yōu)化靶向pc4或pc4上下游靶點(diǎn)的藥物。

30、(3)敲除犬pc4的chmp可以用于評(píng)估敲除pc4后對(duì)犬乳腺腫瘤疾病表型的改善效果，評(píng)估敲除pc4能否起基因治療的效果；還可以用于研究pc4對(duì)化療、放療和靶向治療耐藥性的抵抗機(jī)制。

31、總的來(lái)說(shuō)，利用敲除犬pc4的chmp細(xì)胞系，可以深入研究pc4的基因功能、犬乳腺腫瘤的疾病機(jī)制，還能進(jìn)行犬乳腺腫瘤的藥物開(kāi)發(fā)，擁有新治療策略。

32、因此，本發(fā)明提供上述犬乳腺腫瘤細(xì)胞模型在探究犬乳腺腫瘤發(fā)病機(jī)制中的應(yīng)用。

33、本發(fā)明還提供上述犬乳腺腫瘤細(xì)胞模型在篩選和制備治療犬乳腺腫瘤的藥物中的應(yīng)用。

34、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

35、本發(fā)明提供了一種特異性敲除犬pc4基因的犬乳腺腫瘤細(xì)胞模型及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。本發(fā)明首先設(shè)計(jì)針對(duì)敲除犬pc4基因的sgrna，再構(gòu)建慢病毒轉(zhuǎn)染犬乳腺腫瘤細(xì)胞，最后通過(guò)puro藥物、測(cè)序和western?blot篩選pc4成功敲除的乳腺腫瘤細(xì)胞。結(jié)果表明，利用本發(fā)明提供的構(gòu)建方法能夠成功構(gòu)建敲除pc4的chmp細(xì)胞模型。同時(shí)，本發(fā)明提供的細(xì)胞模型可用于深入研究pc4的基因功能、犬乳腺腫瘤的疾病機(jī)制，還能進(jìn)行犬乳腺腫瘤的藥物開(kāi)發(fā)，為犬乳腺腫瘤的治療探索新的策略。