本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)，具體地，涉及一種表達mil21和4-1bbl的病毒樣顆粒及其在體外擴增nk細胞中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、通過嵌合抗原受體(cars)對免疫細胞進行基因修飾使其靶向殺傷腫瘤細胞，是一種有效的癌癥治療方法。目前，以t細胞為基礎(chǔ)的car-t細胞療法已在臨床應(yīng)用，雖然car-t細胞具有明顯的抗腫瘤活性，但仍存在著一定的臨床局限性，異體car-t會引起強烈的移植物抗宿主病(gvhd)，因此，目前car-t大多是基于自體細胞生產(chǎn)的，其生產(chǎn)過程復(fù)雜、周期較長且成本昂貴。另外部分患者經(jīng)car-t治療后會出現(xiàn)強烈的副作用，如細胞因子釋放綜合征(crs)和神經(jīng)毒性作用。

2、而同為免疫細胞的自然殺傷細胞(nk細胞)在腫瘤治療中有著天然的優(yōu)勢。nk細胞具有非特異性識靶和殺傷機制，可通過非mhc限制的方式殺傷腫瘤細胞，無需抗原預(yù)先致敏，具有較強的免疫監(jiān)視與殺傷功能，且具有多種細胞毒作用機制，能夠通過產(chǎn)生細胞因子調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，在固有免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答中均發(fā)揮關(guān)鍵作用。并且nk細胞對肺癌、肝癌、乳腺癌、淋巴癌等幾乎常見的腫瘤細胞均具有殺傷功能，具有廣譜的抗腫瘤作用。

3、以nk細胞為基礎(chǔ)的car-nk細胞療法將不同來源獲取的nk細胞，通過基因工程的方式修飾nk細胞，使nk細胞表達嵌合抗原受體car，增強其生物學(xué)功能，然后注入患者體內(nèi)以達到特異性殺滅腫瘤細胞的目的。目前，臍血來源的通用型car-nk細胞在淋巴瘤中的治療效果獲得驗證，同時被證實不會發(fā)生嚴重的移植物抗宿主反應(yīng)、細胞因子風(fēng)暴發(fā)生風(fēng)險低、容易實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)、可以實現(xiàn)即用等優(yōu)勢。因此，car-nk有極大的潛力開發(fā)成“萬能通用”的細胞治療產(chǎn)品。

4、通用型car-nk的應(yīng)用范圍為患者每公斤體重需1×106-8×107的cd3-cd56+nk細胞，并需多次回輸。而nk細胞在外周血中的占比僅約為5-15％，臍血中僅約為15％-30％，因此，在用于過繼性免疫治療之前，有必要對nk細胞進行大量擴增。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明的目的在于為本領(lǐng)域提供一種表達mil21和4-1bbl的病毒樣顆粒及其在體外擴增nk細胞中的應(yīng)用。

2、病毒樣顆粒(vlps)是由病毒單一或多個結(jié)構(gòu)蛋白自行裝配而成的高度結(jié)構(gòu)化的蛋白顆粒，在形態(tài)結(jié)構(gòu)上與天然的病毒顆粒相似。vlps缺乏調(diào)節(jié)蛋白和感染性核酸，無復(fù)制能力，具有安全性高等優(yōu)點。本發(fā)明旨在使用vlps使其表達mil21、4-1bbl，以實現(xiàn)nk細胞擴增并且規(guī)避k562細胞的致瘤風(fēng)險。

3、本發(fā)明采用如下技術(shù)方案實現(xiàn)上述發(fā)明目的：

4、本發(fā)明的第一方面提供了一種表達mil21和4-1bbl的病毒樣顆粒b21-vlp。

5、進一步，所述b21-vlp由如下可操作性相連元件依次連接構(gòu)成：mil21、t2a、4-1bbl、t2a、vsv-g；

6、所述mil21的氨基酸序列如seq?id?no.16所示，所述4-1bbl的氨基酸序列如seqid?no.17所示。

7、進一步，所述vsv-g的氨基酸序列如seq?id?no.18所示；

8、可選地，所述mil21的堿基序列如seq?id?no.20所示，所述4-1bbl的堿基序列如seq?id?no.21所示；

9、可選地，所述vsv-g的堿基序列如seq?id?no.22所示。

10、在本發(fā)明中，所述mil21同mbil21，mbil21是在小鼠il21的基礎(chǔ)上進行分子改造得到的。其通常包含il21的功能結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域?qū)τ谄渑c受體的結(jié)合以及發(fā)揮生物學(xué)活性至關(guān)重要。其具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤和抗病毒等作用。在本發(fā)明的具體實施方案中，所述mil21的氨基酸序列如seq?id?no.16所示。

11、在本發(fā)明中，所述4-1bbl是指4-1bb配體，又稱為cd137l，是腫瘤壞死因子超家族的成員之一，在免疫系統(tǒng)中具有重要作用。4-1bbl是一種ⅱ型跨膜蛋白，由306個氨基酸組成。其胞外區(qū)包含171個氨基酸，可被蛋白酶水解形成可溶性的4-1bbl。其具有典型的腫瘤壞死因子超家族結(jié)構(gòu)特征，包括一個β-折疊片層結(jié)構(gòu)和多個α-螺旋，這種結(jié)構(gòu)對于其與受體的結(jié)合和信號傳導(dǎo)至關(guān)重要。在本發(fā)明的具體實施方案中，所述4-1bbl的氨基酸序列如seq?id?no.17所示。

12、在本發(fā)明中，所述t2a是一種來自口蹄疫病毒(fmdv)的2a肽序列。2a肽是一段短肽，在病毒感染過程中能使病毒多聚蛋白在翻譯后進行自我切割，產(chǎn)生多個獨立的功能性蛋白。t2a肽通常由約20個氨基酸組成，具有特定的氨基酸序列和空間結(jié)構(gòu)。t2a可以連接不同類型的基因，無論是編碼結(jié)構(gòu)蛋白還是調(diào)節(jié)蛋白等，都能有效地實現(xiàn)共表達。在本發(fā)明的具體實施方案中，所述t2a的氨基酸序列如seq?id?no.19所示。

13、在本發(fā)明中，所述vsv-g是指水皰性口炎病毒糖蛋白(vesicular?stomatitisvirus?glycoprotein)，是一種跨膜糖蛋白，由511個氨基酸組成，分子量約為67kda。在本發(fā)明的具體實施方案中，所述vsv-g的氨基酸序列如seq?id?no.18所示。

14、本發(fā)明的第二方面提供了一種表達mil21和4-1bbl的病毒樣顆粒b21-vlp的構(gòu)建方法。

15、進一步，所述構(gòu)建方法包括如下步驟：

16、(1)構(gòu)建b21-vsvg包膜質(zhì)粒：

17、(2)使用b21-vsvg包膜質(zhì)粒轉(zhuǎn)染宿主細胞構(gòu)建b21-vlp。

18、進一步，所述構(gòu)建b21-vsvg包膜質(zhì)粒包括如下步驟：

19、(1)通過基因合成獲得mil21和4-1bbl片段，作為片段一，所述mil21的氨基酸序列如seq?id?no.16所示，所述4-1bbl的氨基酸序列如seq?id?no.17所示；

20、(2)以pmd2.g為質(zhì)粒骨架，用ecorⅰ限制性內(nèi)切酶酶切得到片段二；

21、(3)以pmd2.g為質(zhì)粒模板，pcr得到片段三，設(shè)計引物vsvg-f1，5’端到3’端氨基端序列如seq?id?no.1所示，使用同源重組的方法設(shè)計同源臂加到5’端，氨基端序列如seq?idno.2所示，設(shè)計3’端引物vsvg-r1，5’端到3’端氨基端序列如seq?id?no.3所示；

22、(4)將所得的片段一、片段二、片段三利用同源重組酶將其連接，得到完整質(zhì)粒即為b21-vsvg包膜質(zhì)粒。

23、進一步，所述使用b21-vsvg包膜質(zhì)粒轉(zhuǎn)染宿主細胞構(gòu)建b21-vlp包括如下步驟：

24、(1)將包膜質(zhì)粒b21-vsvg和輔助質(zhì)粒pmdlg、prsv混合作為a液，取pei與培養(yǎng)基混合作為b液，a、b液混勻得ab混合液，將ab混合液加入宿主細胞培養(yǎng)基中，培養(yǎng)宿主細胞；

25、(2)3-5h后執(zhí)行換液操作；

26、(3)20-22h后進行補料；

27、(4)包裝后48h進行收獲，得到b21-vlp。

28、在一些實施方案中，所述宿主細胞的培養(yǎng)條件為37℃5％?co2培養(yǎng)箱中，125rpm振蕩培養(yǎng)。

29、進一步，所述包膜質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒的用量分別為：b21-vsvg(1-10)μg、pmdlg(5-50)μg、prsv(1-10)μg；

30、可選地，所述包膜質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒的用量分別為：b21-vsvg?5μg、pmdlg?20μg、prsv?5μg；

31、可選地，所述宿主細胞為293t細胞、293細胞、hek293f細胞、cho細胞、vero細胞或hela細胞；

32、可選地，所述宿主細胞為293t細胞；

33、可選地，所述培養(yǎng)基為瞬轉(zhuǎn)培養(yǎng)基、emcd?hek293?plus培養(yǎng)基、cell-wise?293培養(yǎng)基cw001、完全培養(yǎng)基m293ti、無谷氨酰胺培養(yǎng)基m293tis、無谷氨酰胺無酚紅培養(yǎng)基m293tinpr或union293培養(yǎng)基；

34、可選地，所述培養(yǎng)基為瞬轉(zhuǎn)培養(yǎng)基；

35、可選地，在制備所述a液時，所述培養(yǎng)基的用量為0.5-5ml；

36、可選地，在制備所述a液時，所述培養(yǎng)基的用量為1ml；

37、可選地，在制備所述b液時，所述pei和培養(yǎng)基的用量分別為25-125μl、0.5-5ml；

38、可選地，在制備所述b液時，所述pei和培養(yǎng)基的用量分別為75μl、1ml；

39、可選地，所述補料包括補充葡萄糖、谷氨酰胺。

40、在一些實施方案中，所述換液操作包括如下步驟：將所述宿主細胞1000rpm離心5min后，使用20ml?瞬轉(zhuǎn)培養(yǎng)基重懸細胞，轉(zhuǎn)移至125ml細胞培養(yǎng)搖瓶中。置于37℃5％?co2培養(yǎng)箱中，125rpm振蕩培養(yǎng)。

41、在一些實施方案中，所述補料包括如下步驟：125ml細胞培養(yǎng)搖瓶中加入80μl50％葡萄糖注射液，800μl?l-谷氨酰胺，期間緩慢搖晃混勻，置于37℃5％?co2培養(yǎng)箱中，125rpm振蕩培養(yǎng)。

42、在一些實施方案中，所述收獲包括如下步驟：將宿主細胞懸液轉(zhuǎn)入離心管中，2000rpm離心10min，取上清，為病毒收獲液，使用0.45μm濾膜過濾病毒收獲液，將病毒收獲液轉(zhuǎn)入離心管中，4℃環(huán)境下，升9降0，18300g離心2h，使用含2％?hsa的dpbs重懸病毒沉淀，得到b21-vlp病毒濃縮液。

43、本發(fā)明的第三方面提供了一種包含本發(fā)明第一方面所述b21-vlp的組合物。

44、本發(fā)明的第四方面提供了一種擴增nk細胞的培養(yǎng)物。

45、進一步，所述培養(yǎng)物包含本發(fā)明第一方面所述b21-vlp或本發(fā)明第三方面所述組合物。

46、本發(fā)明的第四方面提供了一種體外擴增nk細胞、體外培養(yǎng)或刺激nk細胞的方法。

47、進一步，所述方法包括：使nk細胞與本發(fā)明第一方面所述b21-vlp、本發(fā)明第三方面所述組合物或本發(fā)明第四方面所述培養(yǎng)物接觸；

48、可選地，所述nk細胞存在于臍血單個核細胞群體中。

49、在一些實施方案中，臍血中含有豐富的造血干細胞和多種免疫細胞，其中包括nk細胞。臍血中的nk細胞具有一些獨特的特點和優(yōu)勢，例如：免疫原性較低、增殖能力較強、抗腫瘤活性、免疫調(diào)節(jié)作用。

50、本發(fā)明的第五方面提供了如下任一方面應(yīng)用：

51、(1)本發(fā)明第一方面所述b21-vlp、本發(fā)明第三方面所述組合物或本發(fā)明第四方面所述培養(yǎng)物在體外擴增nk細胞、體外培養(yǎng)或刺激nk細胞中的應(yīng)用；

52、(2)經(jīng)本發(fā)明第一方面所述b21-vlp、本發(fā)明第三方面所述組合物或本發(fā)明第四方面所述培養(yǎng)物培養(yǎng)得到的nk細胞在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

53、在一些實施方案中，本發(fā)明對所述nk細胞的具體來源并無特別限制，所述nk細胞的來源包括但不限于：骨髓來源的nk細胞、外周血來源的nk細胞、外周淋巴組織來源的nk細胞、胸腺來源的nk細胞、肝臟、肺臟、腸道等非淋巴組織來源的nk細胞。

54、在一些實施方案中，所述腫瘤包括但不限于：血液系統(tǒng)惡性腫瘤、實體腫瘤。其中，所述血液系統(tǒng)惡性腫瘤包括但不限于：急性髓系白血病、非霍奇金淋巴瘤、急性淋巴細胞白血病、慢性淋巴細胞白血病、慢性髓系白血病、霍奇金淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤。所述實體腫瘤包括但不限于：黑色素瘤、腎細胞癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、腦膠質(zhì)瘤、腦膜瘤、鼻咽癌、口腔癌、乳腺癌、食管癌、縱隔腫瘤、胃癌、肝癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌、卵巢癌、宮頸癌、骨肉瘤、尤文肉瘤、軟組織肉瘤、皮膚癌、甲狀腺癌。

55、相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有的有益效果如下：

56、本發(fā)明首次創(chuàng)造性地構(gòu)建了一種全新的表達mil21和4-1bbl的病毒樣顆粒(b21-vlp)，實現(xiàn)了nk細胞的高效擴增并且規(guī)避了k562細胞的致瘤風(fēng)險，此外，所述b21-vlp刺激cbmc時能夠使得nk細胞選擇性擴增，在培養(yǎng)第21天時nk細胞占細胞總含量的90％以上，并且采用所述b21-vlp培養(yǎng)的nk細胞對腫瘤細胞具有較強的殺傷能力，在體外擴增nk細胞這一技術(shù)領(lǐng)域中具有廣闊的應(yīng)用前景。