本發(fā)明涉及免疫，尤其涉及人偏肺病毒單克隆抗體及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、人偏肺病毒（hmpv，human?metapneumovirus）是2001年由荷蘭的研究小組首次分離的單股負(fù)義rna病毒，被分類(lèi)為副粘病毒科、肺病毒亞科、偏肺病毒屬。hmpv根據(jù)血清學(xué)特征被分類(lèi)為a和b這兩種基因型，進(jìn)一步又被分類(lèi)為a1、a2、b1、b2四個(gè)亞型，其中，a2株成為近來(lái)世界范圍內(nèi)流行的主流毒株。hmpv傳播具有季節(jié)性，常見(jiàn)發(fā)病于早春和冬季。hmpv被認(rèn)為是嬰兒呼吸道感染的主要原因，兒童在5歲時(shí)幾乎普遍接觸病原體。盡管hmpv感染大多表現(xiàn)為自限性疾病，但免疫功能受損和老年人可進(jìn)展為重癥肺炎以及細(xì)支氣管炎，出現(xiàn)急性呼吸窘迫綜合征或多器官功能不全等，甚至導(dǎo)致死亡。此外，hmpv被認(rèn)為是sars冠狀病毒引起的嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合癥亞群的共同病原體，也是致命性腦炎發(fā)病的病原體。

2、hmpv?編碼三種表面糖蛋白：附著（g）、小疏水（sh）和融合（f）糖蛋白。f糖蛋白促進(jìn)病毒包膜與宿主細(xì)胞膜的融合，從而介導(dǎo)病毒rna進(jìn)入靶細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)。因此，hmpv?f蛋白被認(rèn)為是產(chǎn)生有效中和和預(yù)防hmpv感染的主要抗原決定簇。由于rsv和hmpv疫苗的研發(fā)在病毒特性、免疫機(jī)制和技術(shù)路線上高度相關(guān)，一些rsv疫苗的經(jīng)驗(yàn)可為hmpv疫苗研發(fā)提供重要參考，推動(dòng)hmpv疫苗的進(jìn)展。目前rsv部分亞單位疫苗已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。針對(duì)f蛋白三聚體設(shè)計(jì)的亞單位疫苗誘導(dǎo)所產(chǎn)生的單克隆抗體可以阻斷病毒與宿主細(xì)胞的融合，從而抑制病毒的復(fù)制和傳播。f蛋白具有的融合前（pre）和融合后（post）兩種構(gòu)象都具有產(chǎn)生中和抗體的能力，但pre-f蛋白相對(duì)于post-f蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)生更強(qiáng)的免疫保護(hù)作用，因此常被視為疫苗設(shè)計(jì)和抗病毒藥物開(kāi)發(fā)的潛在靶點(diǎn)。

3、人偏肺病毒亞單位實(shí)驗(yàn)性疫苗原液純度是疫苗安全性和有效性的關(guān)鍵。在f蛋白的表達(dá)、純化和濃縮過(guò)程中，可能因其環(huán)境條件、化學(xué)試劑、氧化和修飾以及純化方法等原因發(fā)生可能的構(gòu)象變化，部分pre-f轉(zhuǎn)換為post-f,所以確定pre-f的蛋白純度和有效比例，在該實(shí)驗(yàn)性疫苗的研究制備過(guò)程中至關(guān)重要。更高純度的pre-f蛋白作為有效抗原對(duì)于開(kāi)發(fā)hmpv疫苗和治療策略優(yōu)化具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供人偏肺病毒單克隆抗體及其應(yīng)用，本發(fā)明為hmpv亞單位疫苗開(kāi)發(fā)的原液的純度鑒別提供了更具精確、更新穎的檢測(cè)抗體，并為hmpv的診斷和治療及其候選靶標(biāo)的篩選提供可行策略。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明提供了一種單克隆抗體f720-1，所述單克隆抗體f720-1重鏈可變區(qū)的cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列分別如seq?id?no.1的第26-33、51-58、97-107位氨基酸序列所示；

4、所述單克隆抗體f720-1輕鏈可變區(qū)的cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列分別如seqid?no.3的第27-36、54-56、93-100位氨基酸序列所示。

5、本發(fā)明還提供了上述單克隆抗體f720-1的編碼基因，包含如seq?id?no.5所示的720-1h核苷酸序列和如seq?id?no.7所示的720-1l核苷酸序列。

6、本發(fā)明還提供了一種單克隆抗體f390-6，所述單克隆抗體f390-6重鏈可變區(qū)的cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列分別如seq?id?no.2的第26-33、51-58、97-107位氨基酸序列所示；

7、所述單克隆抗體f390-6輕鏈可變區(qū)的cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列分別如seqid?no.4的第27-36、54-56、93-100位氨基酸序列所示。

8、本發(fā)明還提供了上述單克隆抗體f390-6的編碼基因，包含如seq?id?no.6所示的390-6h核苷酸序列和如seq?id?no.8所示的390-6l核苷酸序列。

9、本發(fā)明還提供了上述單克隆抗體f720-1、單克隆抗體f390-6或者編碼基因在制備檢測(cè)人偏肺病毒的試劑或試劑盒中的應(yīng)用。

10、本發(fā)明還提供了上述單克隆抗體f720-1、單克隆抗體f390-6或者編碼基因在制備人偏肺病毒疫苗中的應(yīng)用。

11、本發(fā)明還提供了上述單克隆抗體f720-1、單克隆抗體f390-6或者編碼基因在評(píng)價(jià)人偏肺病毒亞單位疫苗純度中的應(yīng)用。

12、本發(fā)明還提供了一種評(píng)價(jià)人偏肺病毒疫苗純度的方法，包括以下步驟：

13、將本發(fā)明提供的上述單克隆抗體f390-6包被至酶標(biāo)板，封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)；

14、加入待測(cè)樣品，孵育結(jié)合；

15、加入生物素標(biāo)記的本發(fā)明提供的上述單克隆抗體f720-1，孵育；

16、進(jìn)行酶促信號(hào)放大與顯色處理，讀取od值，得到檢測(cè)數(shù)據(jù)；

17、通過(guò)pre-f標(biāo)準(zhǔn)品建立比例標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中pre-f占總f蛋白比例或絕對(duì)濃度，以評(píng)價(jià)人偏肺病毒亞單位疫苗純度。

18、本發(fā)明還提供了一種人偏肺病毒融合前構(gòu)象f蛋白檢測(cè)定量檢測(cè)試劑盒，含有單克隆抗體f720-1和單克隆抗體f390-6。

19、本發(fā)明還提供了一種人偏肺病毒疫苗純度檢測(cè)試劑盒，含有單克隆抗體f720-1和單克隆抗體f390-6。

20、本發(fā)明的有益效果：

21、本發(fā)明通過(guò)雜交瘤技術(shù)篩選并制備出了兩種針對(duì)人偏肺病毒f蛋白的單克隆抗體（命名為f720-1、f390-6），其中單克隆抗體f720-1僅對(duì)人偏肺病毒融合前構(gòu)象f蛋白（pre-f）具有結(jié)合活性，其中所述單克隆抗體f390-6對(duì)人偏肺病毒融合前構(gòu)象f蛋白（pre-f）以及人偏肺病毒融合后構(gòu)象f蛋白（post-f）均具有結(jié)合活性。進(jìn)一步，通過(guò)配對(duì)確定了f720-1和f390-6可以通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附雙抗夾心法對(duì)人偏肺病毒f蛋白中pre-f和post-f進(jìn)行比例檢測(cè)。進(jìn)一步，通過(guò)配對(duì)確定了f720-1和f390-6可以通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附雙抗夾心法對(duì)pre-f進(jìn)行定量。本發(fā)明公開(kāi)了f720-1和f390-6的序列以及酶聯(lián)免疫吸附雙抗夾心法檢測(cè)重組人偏肺病毒疫苗原液中f蛋白pre-f占比測(cè)定的方法。

22、本發(fā)明構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)融合前構(gòu)象f蛋白的質(zhì)粒，搭配不同的免疫佐劑提高蛋白的免疫原性，能夠克服原有pre-f蛋白免疫后血清效價(jià)低的問(wèn)題，有望用于人偏肺病毒疫苗評(píng)價(jià)。

23、本發(fā)明的兩個(gè)單克隆抗體都對(duì)人偏肺病毒pre-f蛋白具有良好的結(jié)合活性，本發(fā)明所提供的f720-1與pre-f結(jié)合的ec50值為0.018μg/ml。本發(fā)明提供的f390-6與pre-f的結(jié)合ec50值為0.016μg/ml。本發(fā)明提供的f720-1結(jié)合的ec50對(duì)post-f值為14.98μg/ml，本發(fā)明提供的f390-6與post-f的結(jié)合ec50值為0.01449μg/ml。

24、本發(fā)明所述的用于檢測(cè)人偏肺病毒融合蛋白pre-f和post-f占比，具有良好線形關(guān)系及擬合度，r2=0.9985。

25、本發(fā)明所述的用于檢測(cè)人偏肺病毒pre-f蛋白最低檢出濃度為0.49?ng/ml，定量范圍在3.91ng/ml至62.5ng/ml的劑量范圍內(nèi)具有線性關(guān)系。