本發(fā)明屬于炎癥性腸病模型構(gòu)建，具體涉及炎癥性腸病模型及其構(gòu)建方法、應(yīng)用和基于其的藥物評(píng)估方法。

背景技術(shù)：

1、炎癥性腸病(inflammatory?bowel?disease,ibd)作為一類(lèi)復(fù)雜的慢性腸道炎癥性疾病，近年來(lái)發(fā)病率持續(xù)攀升，其主要包括克羅恩病(crohn's?disease,cd)和潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative?colitis,uc)，以反復(fù)發(fā)作的腸道炎癥為特征，不僅嚴(yán)重?fù)p害患者的生活質(zhì)量，還給醫(yī)療系統(tǒng)帶來(lái)了巨大的社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。ibd的發(fā)病機(jī)制涉及多因素、多層次的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，包括免疫系統(tǒng)失調(diào)、腸道微生物群紊亂、遺傳易感性以及環(huán)境因素的相互作用，這使得其病理機(jī)制的研究極具挑戰(zhàn)性。在這一背景下，構(gòu)建高效、可靠的體外ibd模型對(duì)于揭示疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制、篩選新型治療靶點(diǎn)以及評(píng)估臨床藥物的療效和安全性具有不可替代的重要意義。

2、目前，ibd研究及其藥物篩選主要依賴于動(dòng)物模型和細(xì)胞模型兩大體系。動(dòng)物模型，尤其是小鼠和大鼠模型，長(zhǎng)期以來(lái)被廣泛應(yīng)用于模擬ibd的病理特征。這些模型主要通過(guò)化學(xué)誘導(dǎo)(如使用硫酸葡聚糖鈉(dextran?sulfate?sodium，dss)、2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzenesulfonic?acid，tnbs)等化學(xué)物質(zhì))或基因工程手段構(gòu)建?；瘜W(xué)誘導(dǎo)模型能夠在一定程度上模擬炎癥的動(dòng)態(tài)進(jìn)程，而基因工程模型則為研究特定基因在疾病中的作用提供了有力工具。與此同時(shí)，隨著細(xì)胞生物學(xué)和組織工程技術(shù)的飛速發(fā)展，細(xì)胞模型逐漸成為ibd研究的新興平臺(tái)。從傳統(tǒng)的2d細(xì)胞系到近年來(lái)快速發(fā)展的3d類(lèi)器官模型，這些體外系統(tǒng)在模擬腸道微環(huán)境、研究細(xì)胞間相互作用以及高通量藥物篩選方面展現(xiàn)出巨大潛力，為ibd研究提供了更為精準(zhǔn)和高效的工具。

3、盡管ibd研究領(lǐng)域在體外模型構(gòu)建方面取得了顯著進(jìn)展，但現(xiàn)有模型仍存在諸多局限性，嚴(yán)重制約了研究的深度和廣度：(1)動(dòng)物模型由于物種間在基因表達(dá)、生理機(jī)制和免疫反應(yīng)等方面存在本質(zhì)差異，導(dǎo)致基于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果難以直接外推至人類(lèi)。此外，動(dòng)物模型的構(gòu)建過(guò)程復(fù)雜、周期漫長(zhǎng)，建模過(guò)程中動(dòng)物個(gè)體不可控，從模型建立到數(shù)據(jù)獲取往往需要耗費(fèi)大量時(shí)間和資源，這不僅增加了研究成本，也嚴(yán)重影響了研究效率，難以滿足快速發(fā)展的醫(yī)學(xué)研究需求。(2)傳統(tǒng)2d細(xì)胞模型雖然具有操作簡(jiǎn)便、來(lái)源穩(wěn)定的優(yōu)勢(shì)，但其缺乏三維空間結(jié)構(gòu)，無(wú)法真實(shí)模擬人體腸道的復(fù)雜微環(huán)境，無(wú)法長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定培養(yǎng)，極大地限制了其在ibd研究中的應(yīng)用價(jià)值。(3)盡管類(lèi)器官等新型細(xì)胞模型在模擬腸道三維結(jié)構(gòu)方面取得了突破性進(jìn)展，但由于培養(yǎng)條件受限、管腔結(jié)構(gòu)封閉以及供氧方式不足等技術(shù)瓶頸，難以實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定培養(yǎng)，從而無(wú)法滿足ibd長(zhǎng)時(shí)程研究的需要。此外，腸道芯片技術(shù)雖然展現(xiàn)了巨大的潛力，但其復(fù)雜的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)和微觀尺度限制，使其在疾病模擬中的應(yīng)用面臨諸多挑戰(zhàn)。上述模型均存在一個(gè)共性問(wèn)題，即，無(wú)法實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定培養(yǎng)，難以高分辨實(shí)時(shí)模擬ibd發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的分子時(shí)空異質(zhì)性，也無(wú)法全面反映炎癥消退后的組織修復(fù)過(guò)程，這極大地限制了研究者對(duì)ibd動(dòng)態(tài)病理機(jī)制的深入理解。因此，開(kāi)發(fā)一種操作簡(jiǎn)便、周期短且能夠精準(zhǔn)模擬人體ibd時(shí)空微環(huán)境的新模型，已成為推動(dòng)該領(lǐng)域突破性進(jìn)展的迫切需求。這種模型需具備長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定培養(yǎng)、高分辨時(shí)空模擬和多維度參數(shù)進(jìn)行藥物評(píng)價(jià)等特征，從而為深入解析ibd的發(fā)病機(jī)制、篩選潛在治療靶點(diǎn)以及評(píng)估藥物療效提供更為可靠的研究平臺(tái)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明的目的在于提供炎癥性腸病模型及其構(gòu)建方法、應(yīng)用和基于其的藥物評(píng)估方法，用以解決現(xiàn)有體外模型無(wú)法維持長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定培養(yǎng)和藥物治療，無(wú)法精準(zhǔn)模擬人體ibd時(shí)空分子特征的技術(shù)問(wèn)題。

2、為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：

3、本發(fā)明的第一個(gè)方面，公開(kāi)了炎癥性腸病模型的構(gòu)建方法，在雙層培養(yǎng)小室transwell上室中加入腸道隱窩-絨毛三維結(jié)構(gòu)和含有硫酸葡聚糖鈉的dmem完全培養(yǎng)基，下室中加入dmem完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)2天，得到炎癥性腸病模型。

4、進(jìn)一步地，含有硫酸葡聚糖鈉的dmem完全培養(yǎng)基中，硫酸葡聚糖鈉的含量為2％。

5、本發(fā)明的第二個(gè)方面，公開(kāi)了上述構(gòu)建方法得到的炎癥性腸病模型。

6、本發(fā)明的第三個(gè)方面，公開(kāi)了炎癥性腸病恢復(fù)模型的構(gòu)建方法，按照上述構(gòu)建方法得到炎癥性腸病模型之后，清洗炎癥性腸病模型，去除上室中的液體，在下室添加dmem完全培養(yǎng)基培養(yǎng)5天，得到炎癥性腸病恢復(fù)模型。

7、本發(fā)明的第四個(gè)方面，公開(kāi)了上述構(gòu)建方法得到的炎癥性腸病恢復(fù)模型。

8、本發(fā)明的第五個(gè)方面，公開(kāi)了炎癥性腸病治療模型的構(gòu)建方法，按照上述構(gòu)建方法得到炎癥性腸病模型之后，清洗炎癥性腸病模型，去除上室中的液體，在上室中添加炎癥性腸病治療藥物，在下室中添加dmem完全培養(yǎng)基培養(yǎng)1～5天，得到炎癥性腸病治療模型。

9、本發(fā)明的第六個(gè)方面，公開(kāi)了上述構(gòu)建方法得到的炎癥性腸病治療模型。

10、本發(fā)明的第七個(gè)方面，公開(kāi)了上述炎癥性腸病模型、炎癥性腸病恢復(fù)模型或炎癥性腸病治療模型在炎癥性腸病發(fā)病機(jī)制研究、炎癥性腸病治療靶點(diǎn)研究或炎癥性腸病藥物篩選中的應(yīng)用。

11、本發(fā)明的第八個(gè)方面，公開(kāi)了治療炎癥性腸病藥物的評(píng)估方法，包括以下步驟：

12、步驟1、分別提取健康腸道模型組織、權(quán)利要求2所述的炎癥性腸病模型組織和權(quán)利要求6所述的炎癥性腸病治療模型組織的結(jié)構(gòu)特征和功能特征，分別計(jì)算各組織的結(jié)構(gòu)特征和功能特征的權(quán)重，得到權(quán)重計(jì)算結(jié)果；

13、步驟2、根據(jù)健康腸道模型組織、權(quán)利要求2所述的炎癥性腸病模型組織和權(quán)利要求6所述的炎癥性腸病治療模型組織的結(jié)構(gòu)特征和功能特征，計(jì)算炎癥性腸病治療模型組織與健康腸道模型組織或炎癥性腸病模型組織之間的結(jié)構(gòu)特征和功能特征的相似性，得到相似性計(jì)算結(jié)果；

14、步驟3、綜合步驟1的權(quán)重計(jì)算結(jié)果和步驟2的相似性計(jì)算結(jié)果，計(jì)算各組織的結(jié)構(gòu)特征和功能特征的加權(quán)f1分?jǐn)?shù)，獲得治療炎癥性腸病藥物藥效的評(píng)估結(jié)果。

15、優(yōu)選地，采用熵權(quán)法計(jì)算結(jié)構(gòu)特征和功能特征的客觀權(quán)重，并結(jié)合專家主觀賦權(quán)，綜合得到權(quán)重計(jì)算結(jié)果。

16、本發(fā)明的第九個(gè)方面，公開(kāi)了評(píng)估方法在炎癥性腸病藥物篩選中的應(yīng)用。

17、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

18、本發(fā)明提供的炎癥性腸病模型的構(gòu)建方法，以硫酸葡聚糖鈉(dss)處理腸道隱窩-絨毛三維結(jié)構(gòu)，得到炎癥性腸病模型，見(jiàn)效快且高度仿真，僅需2天即可完成組織從健康狀態(tài)到炎性狀態(tài)的轉(zhuǎn)變。通過(guò)多維度實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證(teer、免疫熒光、qpcr、western?blot和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序)，證實(shí)該模型能夠精準(zhǔn)模擬真實(shí)人體的炎癥性腸病情況(模擬腸道屏障損傷、炎癥反應(yīng)及信號(hào)通路激活的全過(guò)程)，具有高度仿真的特點(diǎn)。通過(guò)利用該模型評(píng)估臨床陽(yáng)性藥物tofacitinib和upadacitinib的治療效果，發(fā)現(xiàn)upadacitinib在結(jié)構(gòu)修復(fù)和炎癥抑制方面表現(xiàn)最優(yōu)，與臨床觀察結(jié)果高度一致。通過(guò)免疫熒光、qpcr和western?blot實(shí)驗(yàn)證明，無(wú)論在自然恢復(fù)還是藥物治療的情況下，ibd模型受損組織的存活時(shí)間大于5天。因此，該炎癥性腸病模型穩(wěn)定性好，重復(fù)性高，能夠作為炎癥性腸病的發(fā)病機(jī)制研究、藥物篩選及臨床前評(píng)價(jià)的強(qiáng)有力的工具，具有重要的科學(xué)意義和臨床應(yīng)用前景。

19、本發(fā)明提供的炎癥性腸病恢復(fù)模型的構(gòu)建方法，在炎癥性腸病模型的基礎(chǔ)上，通過(guò)系統(tǒng)評(píng)估腸道結(jié)構(gòu)修復(fù)和炎癥消退的動(dòng)態(tài)過(guò)程，揭示了ibd恢復(fù)過(guò)程中結(jié)構(gòu)修復(fù)與免疫反應(yīng)恢復(fù)的不同步現(xiàn)象，為深入研究ibd的病理機(jī)制和藥物干預(yù)效果提供了全新的實(shí)驗(yàn)工具。

20、本發(fā)明提供的治療炎癥性腸病藥物的評(píng)估方法，通過(guò)量化結(jié)構(gòu)特征(如高度、寬度、曲率等)和功能特征(如蛋白分布、轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)等)，獲取權(quán)重計(jì)算結(jié)果，以確定每一組組織的結(jié)構(gòu)或功能參數(shù)占總體的權(quán)重，進(jìn)而評(píng)估結(jié)構(gòu)或功能參數(shù)的重要性；通過(guò)獲取相似性計(jì)算結(jié)果，以確定炎癥性腸病治療模型組織的結(jié)構(gòu)或功能參數(shù)本身與健康腸道模型組織或炎癥性腸病模型組織的相似性水平，綜合權(quán)重計(jì)算結(jié)果和相似性計(jì)算結(jié)果，從而構(gòu)建科學(xué)、全面、多維度的治療炎癥性腸病藥物藥效評(píng)價(jià)模型。該體系能夠直觀反映不同藥物的治療效果，為藥物篩選和臨床前評(píng)價(jià)提供高效、可靠的方案。

21、進(jìn)一步地，在權(quán)重計(jì)算過(guò)程中綜合了熵權(quán)法和專家主觀賦權(quán)，能夠確保評(píng)估結(jié)果兼具數(shù)據(jù)驅(qū)動(dòng)的客觀性和領(lǐng)域?qū)＜业慕?jīng)驗(yàn)判斷。