本發(fā)明屬于植物基因工程育種，具體涉及一種花粉細胞特異表達調(diào)控花粉育性的基因ossyp71b，以及該基因在單子葉植物水稻雜交育種中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、水稻(oryza?sativa?l.)是世界上最重要的糧食作物之一，全世界一半以上的人口以大米為主食。利用雜種優(yōu)勢的雜交育種使得水稻產(chǎn)量大幅提升，作為自花授粉、雌雄同花的植株，水稻雜交育種需要先創(chuàng)制雄性不育系，目前水稻中常用的雜交育種方式是以cms(cytoplasmic?male?sterility)系為基礎(chǔ)的“三系法”育種和以ptgms(photo-thermosensitive?genic?male?sterile?line)系為基礎(chǔ)的“兩系法”育種(wu?et?al.,2016.development?ofa?novel?recessive?genetic?male?sterility?system?for?hybridseed?production?in?maize?and?other?cross-pollinating?crops.plantbiotechnology?journal,14:1046–1054.)。

2、基于花粉育性調(diào)控的雄性不育材料創(chuàng)制是水稻雜交育種的關(guān)鍵，研究在花粉發(fā)育過程中的相關(guān)調(diào)控基因能更好的揭示雄性育性維持分子機理，雄性不育基因的不斷挖掘有利于雜種優(yōu)勢的利用及水稻產(chǎn)量的提高。

3、雖然在擬南芥中，syp72基因突變后，突變體花粉活力明顯下降，且花粉在水合過程中不能維持細胞的完整性，導(dǎo)致花粉破裂不能萌發(fā)。在水稻中，syp72的同源基因的功能并不清楚。(zhou?x,et?al.2022.syp72?interacts?with?the?mechanosensitive?channelmsl8?to?protect?pollen?from?hypoosmotic?shock?during?hydration.naturecommunications,13:73.)。目前水稻雄性不育基因的研究主要依托于ems誘變，根據(jù)花粉不育的表型探究相關(guān)基因。水稻中syp72同源基因的功能未知。

4、水稻雄性不育作為水稻雜交育種的核心環(huán)節(jié)，對其不育基因的克隆和功能分析，不僅能解析水稻顯性雄性核不育形成的遺傳機理，進一步完善水稻雄性不育遺傳機制，同時也為水稻雄性不育的應(yīng)用提供了基因資源和理論依據(jù)。無論從豐富水稻育性資源，還是提升育種效率，對水稻雄性不育基因的研究都顯得重要而迫切。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的第一個目的是提供一種水稻中調(diào)控花粉活力及用于創(chuàng)建水稻雄性不育系的新基因。

2、本發(fā)明的第二個目的是提供一種水稻中調(diào)控花粉活力及用于創(chuàng)建水稻雄性不育系的新蛋白。

3、本發(fā)明的第三個目的是提供一種產(chǎn)生水稻雄性不育的方法。

4、本發(fā)明的第四個目的是花粉特異表達基因和蛋白在育種中的應(yīng)用。

5、本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案給予實現(xiàn)的：

6、本發(fā)明公開了一種水稻花粉特異表達基因ossyp71b，其核苷酸序列如seq?idno.1所示，該基因在花粉中特異性表達，敲除或沉默該基因可導(dǎo)致水稻雄性不育。

7、本發(fā)明中公開的水稻花粉特異表達基因ossyp71b，通過crispr/cas9技術(shù)敲除或沉默ossyp71b基因，導(dǎo)致水稻雄性不育。

8、本發(fā)明還公開了一種水稻花粉特異性表達蛋白，該蛋白的氨基酸序列如seq?idno.2所示，通過crispr/cas9技術(shù)敲除或沉默ossyp71b基因，構(gòu)建敲除或沉默突變體，導(dǎo)致水稻雄性不育。

9、本發(fā)明還公開了一種制備ossyp71b突變體水稻植株的方法，其步驟包括：構(gòu)建ossyp71b敲除質(zhì)粒，將其以水稻日本晴為背景進行遺傳轉(zhuǎn)化，獲得ossyp71b突變體植株。

10、進一步的，所述的制備ossyp71b突變體水稻植株的方法，其步驟包括：

11、①根據(jù)ossyp71b的基因序列，使用在線網(wǎng)站crispr-p2.0分析敲除位點，選擇評分較高且位置合適的兩個靶點；

12、靶點序列：

13、t1：5’-ccgtcgaggtcgatcgatca-3’，

14、t2：5’-ccaagaaggtgaccggaact-3’；

15、②根據(jù)靶點序列和sgrna表達盒的載體序列設(shè)計擴增引物，以u6a-f、dt1-r為配對引物擴增u6a啟動子片段，以dt1-f、dt2-r為配對引物擴增u6b啟動子片段，以dt2-f、sg-r為配對引物擴增sgrna片段，

16、引物序列：

17、u6a-f:atatatggtctcgctcgtggaatcggcagcaaagg，

18、sg-r:atatatggtctcgaccgtccatccactccaagctc，

19、dt1-f:atatatggtctcggtcgatcgatcagttttagagctagaaata，

20、dt1-r:atatatggtctcgcgacctcgacggcggcagccaagccagca，

21、dt2-f:atatatggtctcggtgaccggaactgttttagagctagaaata，

22、dt2-r:atatatggtctcgtcaccttcttggcaacacaagcggcagcg；

23、③利用酶切連接將片段與mh質(zhì)粒連接起來，構(gòu)建完成的mh敲除載體以水稻日本晴為背景進行遺傳轉(zhuǎn)化，獲得ossyp71b突變體植株。

24、更進一步，本發(fā)明公開了構(gòu)建possyp71b::gus表達模式分析載體并進行遺傳轉(zhuǎn)化，篩選陽性株系后，通過gus染色實驗證實了ossyp71b是一個花粉特異表達基因的方法。該方法包括如下步驟：

25、①從水稻基因組中通過pcr擴增possyp71batg前2989bp的啟動子區(qū)域，將possyp71b啟動子連入pc1300-gus載體，獲得possyp71b::gus表達模式分析載體；

26、②將possyp71b::gus表達模式分析載體送往伯遠生物公司進行遺傳轉(zhuǎn)化，獲得轉(zhuǎn)基因植株；

27、③通過gus染色篩選花粉中表達gus信號的植株，即陽性植株；

28、④在hygr上設(shè)計引物，對陽性植株基因組進行pcr擴增，篩選載體分離的陽性純合植株；

29、⑤對篩選到的陽性植株不同組織和花粉進行g(shù)us染色，鑒定ossyp71b的表達模式。

30、進一步的，本發(fā)明公開了通過crispr/cas9技術(shù)構(gòu)建水稻ossyp71b敲除突變株，篩選創(chuàng)建三個純合轉(zhuǎn)基因株系，并對突變體株系表型進行分析的方法，結(jié)果證實ossyp71b基因突變會導(dǎo)致的水稻花粉活力顯著下降，在水合過程中破裂，結(jié)實率下降；這表明ossyp71b與花粉活力及結(jié)實率相關(guān)，為雄性不育系的創(chuàng)制和雜交種子制備提供借鑒。該方法包括以下實驗步驟：

31、①通過邊切邊連的方法將靶點連接到mh質(zhì)粒中，熱激轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，獲得mh-ossyp71b敲除載體；

32、②將mh-ossyp71b敲除載體送往伯遠生物公司進行遺傳轉(zhuǎn)化，獲得轉(zhuǎn)基因植株；

33、③對轉(zhuǎn)基因植株提取基因組dna，針對靶點1和靶點2所在片段范圍進行pcr擴增和測序，根據(jù)測序結(jié)果與日本晴中的ossyp71b基因進行比對。在靶點位置處具有特異性單峰特征的序列，且該序列發(fā)生堿基插入或缺失，則該株系為純合基因型；若靶點位置處具有雙峰特征的突變序列，則該株系為雜合基因型；

34、④通過在cas9位置設(shè)計引物，對t1代轉(zhuǎn)基因植株進行mh-ossyp71b敲除載體分離鑒定，篩選mh-ossyp71b敲除載體分離的純合基因型突變植株；

35、⑤對篩選到的純合基因型突變植株進行表型鑒定，觀察突變植株花粉、結(jié)實率等表型，與野生型進行對比；

36、⑥獲得ossyp71b突變體植株，該突變體花粉活力降低，結(jié)實率較低，花粉在水合過程中會出現(xiàn)破裂導(dǎo)致不能萌發(fā)。

37、進一步的，本發(fā)明還公開了花粉特異表達基因syp72的同源基因在單子葉植物水稻中的功能，利用酵母雙雜交實驗證實了可能是通過機械敏感離子通道蛋白發(fā)揮功能的。

38、本發(fā)明公開了的水稻花粉特異表達基因ossyp71b在制備水稻雄性不育系中的應(yīng)用。

39、本發(fā)明公開了水稻花粉特異性表達蛋白在制備水稻雄性不育系中的應(yīng)用。

40、在本發(fā)明中，“snare”是指soluble?n-ethylmaleimide-sensitive?factorattachmentprotein?receptors，即可溶性n-乙基馬來酰亞胺敏感性因子附著蛋白受體，是一種高度保守的膜轉(zhuǎn)運蛋白，在植物、動物和微生物等物種的囊泡運輸中發(fā)揮重要作用。(gu?et?al.2020.vesicle?transport?in?plants:a?revised?phylogeny?of?snareproteins.evolutionary?bioinformatics?online,16:1612702879.)

41、本文使用的術(shù)語“syp72”是指擬南芥中syp72基因，其在花粉中特異性表達，突變后擬南芥植株花粉活力明顯異常，花粉水合過程中無法維持細胞完整性導(dǎo)致破裂，角果明顯變小，結(jié)實率顯著降低(zhou,et?al.2022.syp72interacts?with?themechanosensitive?channel?msl8?to?protect?pollen?from?hypoosmotic?shockduringhydration.nature?communications,13:73.)。

42、本文使用的術(shù)語“基因編輯(gene?editing)”，是一種較精確的能對生物體基因組靶基因進行修飾的一種新興基因工程技術(shù)。該技術(shù)能夠?qū)δ繕嘶蜻M行定點“編輯”，實現(xiàn)對特定dna片段的修飾?；蚓庉嬕蕾囉诮?jīng)過基因工程改造的核酸酶，也稱“分子剪刀”，在基因組中特定位置產(chǎn)生位點特異性雙鏈斷裂(dsb)，誘導(dǎo)生物體通過非同源末端連接(nhej)或同源重組(hr)來修復(fù)dsb，因為這個修復(fù)過程容易出錯，從而導(dǎo)致靶向定點突變。

43、本文使用的術(shù)語“crispr/cas9”是指使用sgrna引導(dǎo)鏈靶向內(nèi)切核酸酶切割位點的內(nèi)切核酸酶，一種近年廣為應(yīng)用的定點突變技術(shù)。

44、本文定義被子植物syp72同源基因是指具備以下特征的基因：

45、(1)具有snare蛋白家族的保守結(jié)構(gòu)域；

46、(2)編碼的蛋白具有分泌性。

47、(3)在花粉中特異性表達。

48、本發(fā)明中使用的生物材料，都可從公司購得，也可聯(lián)系武漢大學雜交水稻國家重點實驗室，或可從已發(fā)表的文章中獲取。

49、本發(fā)明的優(yōu)點：

50、采用crispr/cas9技術(shù)在水稻中構(gòu)建ossyp71b的敲除突變體，揭示ossyp71b在花粉發(fā)育后期過程中的功能，為水稻雄性不育系的創(chuàng)建和雜交育種提供借鑒。本發(fā)明的優(yōu)點主要體現(xiàn)在以下幾個方面：

51、(1)揭示了snare蛋白ossyp71b在水稻花粉發(fā)育過程中所發(fā)揮的功能；

52、(2)證實了ossyp71b是一個花粉特異表達的基因，基因功能缺失會導(dǎo)致花粉活力顯著降低和結(jié)實率下降，對水稻雄性不育系系創(chuàng)制和雜交育種具有重要的借鑒意義。

53、(3)為揭示囊泡運輸相關(guān)snare家族蛋白在單子葉植物水稻花粉發(fā)育過程中的生物學功能研究提供新思路。